Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em> Ex-vivo-</em> Fibroblasten

Summary

Molecular Profiling von Laser mikrodissektiert Zellen und Stroma aus synthetischen, Tissue-Engineering-Darmkrebs-Modelle stellt einen neuartigen Ansatz zur manipulierbaren und an der Schnittstelle zwischen Tumorzellen zu charakterisieren und zu sezieren die unverwechselbare Biologie an der invasiven Front und Krebs Stromazellen.

Abstract

Invasion Darmkrebs (CRC)-Zellen haben die Fähigkeit, aus ihrer Schwesterzellen zu befreien, das Stroma zu infiltrieren, und renovieren die extrazelluläre Matrix (ECM) erworben. Charakterisierung der Biologie dieser phänotypisch bestimmte Gruppe von Zellen könnte wesentlich unser Verständnis der frühen Ereignisse verbessern während der metastatischen Kaskade.

Tumorinvasion ist ein dynamischer Prozess, durch bidirektionale Interaktion zwischen dem Epithel und malignem Krebs Stroma erleichtert. Um Zell-spezifische Antworten auf den Tumor-Stroma-Schnittstelle haben wir organotypischen Kokultur und Laser Mikrodissektion Techniken kombiniert untersuchen.

Organotypische Modelle, in denen wichtige Bestandteile wie Stroma-Fibroblasten sind 3-dimentioanally co-kultiviert mit Krebs Epithelzellen, sind sehr manipulierbar experimentelle Werkzeuge, die Invasion und Krebs-Stroma-Interaktionen ermöglichen, in der Nähe von-ph studiert werdenysiological Bedingungen.

Laser Mikrodissektion (LMD) ist eine Technik, die die chirurgische Präparation und Extraktion der verschiedenen Schichten im Tumorgewebe, mit Mikrometer-Präzision Niveau bringt.

Durch die Kombination dieser Techniken mit genomischer, Transkriptom und epigenetische Profiling wollen wir zu einem tieferen Verständnis der molekularen Eigenschaften der Invasion von Tumorzellen und die umliegenden Stroma-Gewebe zu entwickeln, und dabei möglicherweise offenbaren neue Biomarker und Chancen für die Entwicklung von Medikamenten in CRC.

Introduction

Organotypische Co-Kulturen sind Tissue-Engineering-Modelle, die Hilfe bei der Rekonstruktion der in vivo Tumor-Mikroumgebung in drei Dimensionen durch Nebeneinander malignen Epithelzellen und Stromazellen in einem Kollagen-Gel, die wesentliche Komponenten der extrazellulären Matrix ^3.1. Hauptsächlich als ein Verfahren zur Messung der Tumorinvasion konzipiert, organotypics die Abhängigkeit von in vivo-Tiermodellen, und vermeiden die Nachteile der anderen in vitro-Techniken, wie Transwell-Assays, bei dem eindringenden Zellen künstlich in einem monodispersen Zustand ^2-4 gedrückt. Die Einbeziehung von Stromazellen in diesen Modellen, wie Fibroblasten, spiegelt die wesentliche Rolle der Tumor-Mikroumgebung bei der Regulierung der Invasion und Metastasierung maligner ^3-4, jedoch ist die phänotypische Heterogenität des Stroma ist derart, dass, um die physiologische Relevanz der organotypischen maximieren Modelle, organspezifische, anatomisch genaue ex vivoFibroblasten aufgenommen werden sollten, wo immer möglich ^3,6.

Organotypics sind eine vielseitige Plattform, um Interaktionen zwischen Tumor-und Stromazellen studieren und werden zunehmend in neue Wege, um die Auswirkungen auf die Tumor-Invasion von chemischen Inhibitoren und gezielten Genveränderungen ^7,8 untersuchen eingesetzt. Das Studium der invasiven Tumorrand ist eine besonders aufregende Aussicht. In organotypischen Modellen etabliert Darmkrebs (CRC) Zelllinien in der Regel eine gut geschichtete Epithel, und im Querschnitt, Zellen, die die Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix (ECM) eindringen erworben haben, sind leicht erkennbar. Angesichts der etablierten Mikro-topographische Heterogenität von Tumor-und Tumor-assoziierten Stroma-Zellen in vivo, Extrahieren, diese Zellen mit Laser-Mikrodissektion und studiert sie in Isolation, können wichtige biologische Erkenntnisse über die Entstehung von Darmkrebs Metastasen zeigen, und wie kann es effizienter sein richtet. Ichn die folgende Methode, alle Patienten, die Gewebeproben eine schriftliche Einverständniserklärung, und die Studie wurde gespendet von den Institutionen regionaler Forschungsethikkommission genehmigt.

Protocol

1. Gründung der Primär Fibroblasten-Kulturen von Darm Explantate Erhalten Proben von normalem menschlichen Darmschleimhaut Gewebe direkt von der chirurgischen Operationssaal und Aussetzung in 7-10 ml PBS, ergänzt mit 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 &mgr; g / ml Fungizon. Im Labor stellen die Probe in der Mitte einer 10-cm-Gewebekulturschale und 3 x waschen mit PBS / Pen-Strep / Fungizone. Nach dem letzten Waschen saugen nicht. Mit einer sterilen Pinz…

Representative Results

Wir haben das obige Verfahren, um mehrere Kombinationen von CRC-Zelllinien und Stromazellen aufgebracht. Ein Beispiel hier präsentiert wird, ist SW480 CRC epithelialen Zelllinien mit primären humanen ex vivo Darm Fibroblasten. 3-dimensionale Co-Kulturen sind zum Vergleich der unterschiedlich exprimierten miRNAs zwischen Zellen an der invasiven Tumorfront ausgebildet (Fig. 1), um Mikroskopie und Laser-Capture-Mikrodissektion (Fig. 2) unterzogen und durch microRNA (miRNA) Profi…

Discussion

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um spezifisch zu isolieren und zu charakterisieren, Tumorzellen, die die Fähigkeit, den Krebs Stroma in den frühesten Stadien der metastatische Fortschreiten in einer 3-dimensionalen Co-Kultur-Konstrukt von epithelialen und stromalen Zellen eindringen erworben.

Co-Kultur-Modelle der CRC-Epithelzellen mit einem synthetischen Stroma enthält ex vivo menschlichen Kolon-Fibroblasten nebeneinander bestehen wurden verwendet, um CRC-Invasion in 3-Dimen…

Materials

Colorectal cancer cell lines – example shown SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Collagen	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Nylon membrane	Merck Millipore	VVLP01300
Metal grid	The Mesh Company	WSS20-A4	themeshcompany.com
Laser microdissection platform	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Membrane mounted slides	Molecular devices
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025