Molekylær Profilering av Invasive Tumor mikromiljøet i en 3-dimensjonal modell av kolorektal kreft celler og<em> Ex vivo</em> Fibroblaster

Summary

Molekylær profilering av laser microdissected celler og stroma fra syntetiske, vev-konstruerte kolorektal kreft modellene representerer en ny og påvirkelig tilnærming til karakterisere og dissekere den særegne biologi i skjæringspunktet mellom kreftceller ved invasiv foran og kreft forbundet stromale celler.

Abstract

Invaderende tykktarmskreft (CRC) celler har ervervet kapasitet til å bryte fri fra sine søster celler, infiltrere stroma, og fornye den ekstracellulære matrix (ECM). Karakteriserer biologien til dette fenotypisk distinkt gruppe av celler kunne vesentlig forbedre vår forståelse av tidlige hendelser i løpet av metastatisk kaskade.

Tumor invasjonen er en dynamisk prosess tilrettelagt av toveis interaksjoner mellom ondartet epitel og kreft forbundet stroma. For å undersøke cellespesifikk respons på svulsten stroma-grensesnittet har vi kombinert organotypic ko-kultur og lasermikro disseksjon teknikker.

Organotypic modeller, hvor sentrale stromal bestanddeler som fibroblaster er 3-dimentioanally co-kultivert med kreft epitelceller, er svært påvirkelig eksperimentelle verktøy som gjør det mulig invasjon og kreft-stroma interaksjoner som skal studeres i nær-physiological forhold.

Laser mikrodisseksjon (LMD) er en teknikk som innebærer den kirurgiske disseksjon og utvinning av de forskjellige strata i tumorvevet, med mikrometer-nivå presisjon.

Ved å kombinere disse teknikkene med genomisk, transcriptomic og epigenetisk profilering har vi som mål å utvikle en dypere forståelse av de molekylære egenskapene til invaderende kreftceller og omkringliggende stromal vev, og dermed potensielt avdekke nye biomarkører og muligheter for legemiddelutvikling i CRC.

Introduction

Organotypic co-kulturer er vev-konstruerte modeller som hjelpemiddel i å rekonstruere in vivo tumor mikromiljøet i tre dimensjoner ved å sidestille ondartede epitelceller og stromale celler i en kollagen gel inneholder essensielle ekstracellulære matrikskomponenter ^1-3. Prinsipielt oppfattet som en metode for å måle tumorinvasjon, organotypics redusere avhengigheten av in vivo dyremodeller, og unngå ulempene ved andre in vitro-teknikker som Transwell-analyser, hvori invaderende celler blir tvunget inn i en kunstig mono-dispergert tilstand ^2-4. Inkludering av stromale celler i disse modellene, slik som fibroblaster, reflekterer den essensielle rolle tumor mikromiljøet i regulering ondartet invasjon og metastase ^3-4, men den fenotypiske heterogenitet av stroma er slik at for å maksimere den fysiologiske relevans av organotypic modeller, organspesifikk, anatomisk korrekt ex vivofibroblaster bør inkluderes der det er mulig ^3,6.

Organotypics er en allsidig plattform for å studere samspillet mellom tumor og stromale celler og blir stadig mer brukt i romanen måter å undersøke effekten på tumor invasjon av kjemiske hemmere og målrettede genet endringer ^7,8. Studerer invasiv svulst margin er en spesielt spennende prospekt. I organotypic modeller, etablert kolorektal kreft (CRC) cellelinjer som produserer vanligvis en brønn stratifisert epitel lag, og i tverrsnitt, celler som har ervervet evnen til å invadere den ekstracellulære matriks (ECM) er lett synlige. I lys av den etablerte mikro topografisk heterogenitet av tumor og tumorassosierte stromale celler in vivo, trekke disse cellene ved hjelp av laser microdissection og studere dem i isolasjon, kan avsløre viktige biologiske innsikt om opprinnelsen til kolorektal kreft metastasering, og hvordan det kan være mer effektivt målrettet. Jegn følgende metodikk, alle pasienter som har donert vevsprøver gitt skriftlig informert samtykke, og studien ble godkjent av institusjonene regionale forskningsetiske komité.

Protocol

En. Etablering av Primary fibroblastkulturer fra Tykktarms explants Få tak i prøver av normal menneskelig kolon slimhinnen vev direkte fra kirurgisk operasjonssalen, og suspendere i 7-10 ml PBS supplert med 100 enheter / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, og 0,25 mg / ml Fungizone. I laboratoriet, plassere prøven i sentrum av en 10-cm vev kultur fatet og vask tre ganger med PBS / Pen-strep / Fungizone. Ikke aspirer etter siste vask. Med steril tang og skalpell, skjære veve…

Representative Results

Vi har benyttet den ovennevnte fremgangsmåte til flere kombinasjoner av CRC-cellelinjer og stromale celler. Ett eksempel som presenteres her er SW480 epitel CRC cellelinjer med primære humane ex vivo colonic fibroblaster. Tre-dimensjonale ko-kulturer blir konstruert (figur 1), utsettes for mikroskopi og laser-fangst mikrodisseksjon (figur 2), og analysert ved mikroRNA (miRNA) profilering (figur 3) for sammenligning av differensielt uttrykte miRNAs mellom cell…

Discussion

Her beskriver vi en fremgangsmåte for spesifikt å isolere og karakterisere tumor-celler som har ervervet evnen til å invadere cancer assosiert stroma i de tidligste stadier av metastatisk progresjon i en 3-dimensjonal ko-kultur konstruksjon av epithelial og stromale celler.

Co-kultur modeller består av CRC epitelceller sidestilt med en syntetisk stroma inneholder ex vivo humane colonic fibroblaster ble brukt til å studere CRC invasjon i tre dimensjoner. Dette fysiologisk releva…

Materials

Colorectal cancer cell lines – example shown SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Collagen	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Nylon membrane	Merck Millipore	VVLP01300
Metal grid	The Mesh Company	WSS20-A4	themeshcompany.com
Laser microdissection platform	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Membrane mounted slides	Molecular devices
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025