Перерезки спинного шнур в личиночной данио рерио
Summary
После перерезки спинного, взрослые данио имеют функциональное восстановление по шести недель после травмы. Для того чтобы воспользоваться личиночной прозрачности и ускорения восстановления, мы представляем метод для пересекающих личинок спинной мозг. После перерезки, мы наблюдаем сенсорную восстановление начиная с 2-х дней после травмы, и С-образный изгиб движение на 3 дня после травмы.
Abstract
Млекопитающие неудачу в сенсорной и моторной восстановления следующие повреждения спинного мозга из-за нехватки аксонов отрастания ниже уровня травмы, а также неспособности возобновить спинного нейрогенез. Однако некоторые anamniotes в том числе данио рерио Danio демонстрируют оба сенсорной и функциональное восстановление даже после полной перерезки спинного мозга. Взрослый данио является признанным модельный организм для изучения регенерации следующие повреждения спинного мозга, с сенсорной и моторной восстановления по 6 недель после травмы. Для того чтобы воспользоваться анализа в естественных условиях регенеративного процесса доступный в прозрачном личинок рыбок данио, а также генетические инструменты не доступны во взрослом, мы используем личиночной данио для изучения регенерации после перерезки спинного мозга. Здесь мы показываем, метод воспроизводства и проверяемым, пересекающих личинок спинной мозг. После перерезки, наши данные показывают, начало сенсорная восстановления на 2 дня после травмы (руб), остроумиеч С-изгиб движение обнаруживается на 3 руб и возобновления свободное плавание на 5 руб. Таким образом мы предлагаем личиночной данио в качестве компаньона инструмент в взрослых данио для изучения восстановления после травмы спинного мозга.
Introduction
Основные травмы спинного мозга человека часто приводит к постоянному параличу и потере чувствительности ниже уровня травмы, в связи с невозможностью вырастить аксоны или возобновить нейрогенез 1,2. В отличие от млекопитающих, однако, anamniotes включая саламандры и рыбок данио (Danio рерио) показать уверенное восстановление даже после полной перерезки спинного мозга 3,4.
Взрослый данио является устоявшейся моделью для изучения процесса восстановления следующем повреждением спинного мозга 5-7. После полной перерезки спинного мозга, восстановление сенсорной и локомотивного функции наблюдается в взрослых данио на 6 недель после травмы 8. Для того чтобы исследовать процесс регенерации в естественных условиях, мы обратились к прозрачной личиночной данио 9.
Здесь мы представляем метод разреза спинного мозга из 5 дней после оплодотворения (DPF) личиночной данио USIнг скошенную микроинъекции пипетки как скальпелем, модифицированный из Бхатт, и др.. 10 Этот метод поддерживает высокую пропускную способность, низкий смертности, и воспроизводимость. С практикой, 300 личинок / ч может быть перерезана, и свыше 6 месяцев transections, в том числе более 3600 животных, 98.75% ± 0,72% дожили до 7 дней после травмы (точек на дюйм). Наши данные показывают, быстрое восстановление сенсорной и передвижения, а также: на 1 руб, все движения потерпевшей рыбы движет только грудного плавника передвижения. Тем не менее, личинки начинают реагировать на вольфрамовой иглы сенсорный каудальнее перерезки на 2 руб, восстановить С-изгиба движение на 3 руб, а также отображать хищный плавание на 5 руб 11. Использование окрашивание антител против ацетилированного тубулина, мы подтвердили, что аксоны отсутствуют в месте повреждения на 1 руб, но пересекли место повреждения на 5 руб. Мы считаем, что это протокол предоставит ценную технику для изучения аксонов отрастания и нейрогенеза в спинном мозге после травмы. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
При первоначальном изучении этой техники, мы рекомендуем пытаться не более 50-100 transections в течение одной сессии. После освоения этой техники, мы в состоянии секут до 300 эмбрионов в час; Однако этот уровень пропускной требуется несколько месяцев еженедельной практике. Мы также рекомендуем …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы в долгу перед Университета Юты данио объекта для животноводства. RID поддержали NIH R56NS053897, и LKB был predoctoral стажер поддержке инициативы HHMI Мед-В-Град.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
