La transección de la médula espinal en el pez cebra larval
Summary
Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.
Abstract
Mamíferos fallan en la recuperación sensorial y motora después de una lesión de la médula espinal debido a la falta de regeneración axonal por debajo del nivel de la lesión, así como una incapacidad para reiniciar la neurogénesis médula. Sin embargo, algunos anamniotes incluyendo el pez cebra exposición Danio rerio tanto sensorial y la recuperación funcional, incluso después de la transección completa de la médula espinal. El pez cebra adulto es un organismo modelo establecido para el estudio de la regeneración después de una lesión de la médula espinal, con la recuperación motora y sensitiva a las 6 semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas del análisis in vivo del proceso regenerativo disponible en la larvas de pez cebra transparente, así como herramientas genéticas no son accesibles en el adulto, usamos la larvas de pez cebra para estudiar la regeneración después del corte transversal de la médula espinal. Aquí se demuestra un método para reproducible y verificable transección de la médula espinal de las larvas. Después de transección, nuestros datos muestran principio de recuperación sensorial a los 2 días después de la lesión (ppp), ingenioh del movimiento C-bend detectable por 3 dpi y la reanudación de la natación libre por 5 dpi. Por lo tanto se propone la larvas de pez cebra como una herramienta complementaria para el pez cebra adulto para el estudio de la recuperación después de una lesión de la médula espinal.
Introduction
Mayor trauma en la médula espinal humana a menudo resulta en la parálisis permanente y pérdida de la sensación por debajo del nivel de la lesión, debido a la incapacidad para volver a crecer los axones o reiniciar la neurogénesis 1,2. A diferencia de los mamíferos, sin embargo, anamniotes incluyendo salamandras y el pez cebra (Danio rerio) muestran recuperación robusta, incluso después de la sección completa de la médula espinal 3,4.
El pez cebra adultos es un modelo bien establecido para estudiar el proceso de recuperación tras la lesión de la médula espinal 5-7. Después de la transección completa de la médula espinal, restablecimiento de la función sensorial y la locomotora se observa en el pez cebra adultos por 6 semanas después de la lesión 8. Con el fin de examinar el proceso de regeneración in vivo, recurrimos a la larvas de pez cebra transparente 9.
Aquí presentamos un método para seccionar la médula espinal de un 5 días después de la fertilización (dpf) larval usi pez cebrang de una pipeta de microinyección biselado como un bisturí, modificado a partir de Bhatt, et al. 10 Este método es compatible con alto rendimiento, baja mortalidad, y la reproducibilidad. Con la práctica, 300 larvas / hr puede secciona, y más de 6 meses de cortes transversales, incluyendo más de 3.600 animales, 98,75% ± 0,72% sobrevivió hasta 7 días después de la lesión (dpi). Nuestros datos muestran una rápida recuperación de la locomoción y sensorial, así: al 1 dpi, todos los movimientos de los peces heridos es impulsado por pectoral sólo locomoción aleta. Sin embargo, las larvas comienzan a responder al tungsteno aguja toque caudal a la transección por 2 dpi, restablecer el movimiento C-doble por 3 dpi, y mostrar la natación predatorias de 5 11 dpi. El uso de la tinción de anticuerpos contra la tubulina acetilada, hemos confirmado que los axones están ausentes en el sitio de la lesión en 1 dpi, pero hemos cruzado el sitio de la lesión por 5 dpi. Creemos que este protocolo proporcionará una técnica valiosa para el estudio de la regeneración axonal y la neurogénesis en la médula espinal después de una lesión. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuando se aprende inicialmente esta técnica, se recomienda intentar no más de 50 a 100 transectos en una sola sesión. Después de dominar esta técnica, que son capaces de seccionar hasta 300 embriones por hora; Sin embargo, este nivel de rendimiento requiere de unos meses de práctica semanal. También se recomienda la práctica con un reportero línea y la verificación de la transección completa hasta la incidencia de la transección de la médula espinal incompleta se reduce a menos de 1%.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos en deuda con la instalación de pez cebra de la Universidad de Utah para la cría de animales. RID fue apoyado por el NIH R56NS053897 y LKB era un aprendiz predoctoral con el apoyo de la iniciativa del HHMI Med-Into-Grad.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
References
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