Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten
Summary
Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) mit hoher Kapazität, in ihren extrazellulären Umgebung phagozytieren oder verschlingen Material. Hier ist eine breit anwendbare, zuverlässige und hoch quantitativen Assay für die Visualisierung und Messung Mikroglia-vermittelte Phagozytose von synaptischen Komponenten beschrieben.
Abstract
Phagozytose ist ein Prozess, in dem eine Zelle verschlingt Material (gesamte Zelle, Zellteile, Schutt, etc.) in der extrazellulären Umgebung umgibt und dieses Material anschließend verdaut, allgemein durch lysosomalen Abbau. Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), deren phagozytierenden Funktion in einem breiten Bereich von Bedingungen, die an neurodegenerativen Erkrankungen (z. B. beta-Amyloid-Clearance bei Alzheimer-Krankheit), um die Entwicklung von gesunden Gehirn (zB synaptischen beschrieben Beschneiden) 1-6. Das folgende Protokoll ist ein Einwirkung Assay entwickelt, zu visualisieren und zu quantifizieren Mikroglia-vermittelten Phagozytose von präsynaptischen Eingänge in den Entwicklungs Maus retinogeniculate System 7. Während dieser Assay wurde verwendet, um Mikroglia-Funktion in diesem Zusammenhang zu bewerten, kann ein ähnlicher Ansatz verwendet werden, um andere Phagozyten im Gehirn (beispielsweise Astrozyten) und dem Rest des Körpers zu beurteilen(Z. B. peripheren Makrophagen) sowie andere Kontexte, in denen die synaptische Umbau auftritt (z. B. Hirnverletzung / Krankheit).
Introduction
Synaptischen Schaltungen umzu während der gesamten Lebensdauer des Tieres. In der sich entwickelnden Gehirn, Synapsen im Überschuss und muss synaptischen Beschneidung, die die selektive Entfernung einer Teilmenge von Synapsen und die Erhaltung und Stärkung dieser Synapsen, die 8-10 bleiben beinhaltet zu unterziehen. Dieser Vorgang ist notwendig, um die genaue Verbindungscharakteristik des adulten Nervensystems zu erreichen. Beim Erwachsenen kann Synapsen auch Kunststoff sein, insbesondere im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis. Die strukturellen Korrelate dieser Plastizität sind gedacht, um das Hinzufügen und / oder Beseitigung von dendritischen Dornen und präsynaptischen Boutons 11-13 enthalten. Zusätzlich zu diesen Rollen in der gesunden Nervensystems, wird synaptischen Umbau auch im Nervensystem Krankheit / Verletzung 12,14,15 beteiligt. Zum Beispiel, nach Rückenmarksverletzungen, abgetrennten Axone müssen anschließend umzugestalten und bilden neue Synapsen, um die funktionelle Erholung von 16 bis 19 zu erreichen.
nt "> Schwellen als ein wichtiger Aspekt der synaptischen Plastizität ist der Prozess der Phagozytose oder Einwirkung von Synapsen für die Entfernung 3,5,20 bestimmt. Wir haben kürzlich gezeigt, dieses Phänomen im Rahmen der synaptischen Rebschnitt in der gesunden, postnatalen Gehirn der Maus 7. Insbesondere Mikroglia, die ansässige ZNS Immunzellen und Fresszellen, wurde gezeigt, präsynaptischen Eingänge während einer Spitzenzeit und in einem Bereich von Entwicklungs synaptischen Rebschnitt, der postnatalen dorsalen seitlichen Kniehöcker (dCGL) des Thalamus zu verschlingen. genetische oder pharmakologische Blockade dieser Einwirkung führte zu anhaltenden Defizite in der synaptischen Verbindungen.In diesem Protokoll beschreiben wir eine zuverlässige und hoch quantitative Assay Phagozyten-vermittelte Phagozytose von präsynaptischen Eingänge messen. Für die Zwecke dieses Artikels wird dieser Test im Rahmen der Entwicklungs retinogeniculate System, das Netzhautganglienzellen beinhalten (RGCs), die sich in der Netzhaut angebracht werden, dassprojizieren präsynaptische Eingänge des dCGL (Fig. 1A). Um zu beginnen, wird ein lysosomalen Degradation beständigen anterograde Markierungsstrategie beschrieben, die verwendet wird, um RGC-spezifischen präsynaptischen Eingänge im dCGL (Fig. 1) 7,21 visualisieren. Nach dieser Beschreibung wird eine detaillierte Methode zur Bildgebung und quantitativen Messung Einwirkung mittels konfokaler Mikroskopie in Kombination mit der 3-dimensionalen (3D) Volumen-Rendering Oberfläche gegeben werden. Diese Methodik basiert auf fixierten Gewebepräparation kann aber auch zur Verwendung bei Echtzeit-Bildgebung Studien angepasst werden. Wichtig ist, während der Test wurde im Rahmen des gesunden, postnatale retinogeniculate Systems validiert worden sind, könnte man die gleichen Verfahren anzuwenden, um andere Phagozyten-Neuron-Interaktionen im Gehirn und während Krankheit sowie Phagozytenfunktion in anderen Organsystemen zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um genau zu messen, Phagozytose, müssen verschlungen Material in einer Weise, dass der Forscher kann es einmal zu visualisieren lysosomalen Abbau aufgetreten gekennzeichnet werden. Außerdem wird eine hochauflösende Abbildung benötigt wird, gefolgt von der Verwendung von Software, die dem Forscher ermöglichen, das Volumen der gesamten Zell visualisieren und zu quantifizieren, dessen Inhalt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine sehr zuverlässige und quantitative Verfahren zur Messung von Phagozyten-vermittelte E…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
, NRSA (F32-NS-066698; DPS); Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Smith Family Foundation (BS), Dana-Stiftung (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801) unterstützt wird, Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
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