एक घिराव परख: सीएनएस फ़ैगोसाइट और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल
Summary
Microglia उनके बाह्य वातावरण में सामग्री phagocytose या निगल करने के लिए एक उच्च क्षमता के साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं. इधर, synaptic घटकों के microglia की मध्यस्थता घिराव दृश्यमान करने और मापने के लिए एक मोटे तौर पर लागू विश्वसनीय, और अत्यधिक मात्रात्मक परख वर्णित है.
Abstract
Phagocytosis एक सेल उसके आसपास के बाह्य वातावरण में सामग्री (संपूर्ण सेल, एक सेल, मलबे, आदि के कुछ हिस्सों) समाई है और बाद में सामान्यतः lysosomal गिरावट के माध्यम से, इस सामग्री को हज़म जिसमें एक प्रक्रिया है. Microglia जिसका phagocytic समारोह neurodegenerative रोग स्वस्थ मस्तिष्क का विकास करने के लिए (अल्जाइमर रोग में जैसे, बीटा amyloid निकासी) (जैसे, synaptic से स्थितियों की एक विस्तृत रेंज में वर्णित किया गया है केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं छंटाई) 1-6. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के विकास माउस retinogeniculate प्रणाली 7 में presynaptic आदानों की microglia की मध्यस्थता घिराव कल्पना और यों के लिए विकसित की एक घिराव परख है. इस परख इस विशेष संदर्भ में microglia समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, वहीं एक समान दृष्टिकोण मस्तिष्क (जैसे, astrocytes) और शरीर के बाकी भर में अन्य फ़ैगोसाइट का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है(जैसे, परिधीय मैक्रोफेज) के रूप में भी synaptic remodeling है जिसमें वह अन्य संदर्भों (जैसे, मस्तिष्क की चोट / बीमारी).
Introduction
Synaptic सर्किट एक जानवर के जीवन भर फिर से तैयार. विकासशील मस्तिष्क में, synapses अधिक फार्म और synapses के एक सबसेट के चुनिंदा हटाने और 8-10 रहते हैं कि उन synapses के रखरखाव और मजबूत बनाने शामिल है जो synaptic छंटाई से गुजरना होगा. इस प्रक्रिया वयस्क तंत्रिका तंत्र की सटीक कनेक्टिविटी विशेषता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. वयस्क में, synapses भी विशेष रूप से सीखने और स्मृति के संदर्भ में, प्लास्टिक हो सकता है. इस plasticity की संरचनात्मक संबद्ध वृक्ष के समान spines और presynaptic BOUTONS 11-13 के अलावा और / या उन्मूलन शामिल करने के लिए लगा रहे हैं. स्वस्थ तंत्रिका तंत्र में इन भूमिकाओं के अलावा, synaptic remodeling भी तंत्रिका तंत्र रोग / चोट 12,14,15 में शामिल है. उदाहरण के लिए, रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद, कटे axons बाद में फिर से तैयार और कार्यात्मक वसूली 16-19 हासिल करने के लिए नए synapses फार्म चाहिए.
NT "> synaptic plasticity का एक महत्वपूर्ण पहलू के रूप में उभरते phagocytosis या हटाने 3,5,20 के लिए किस्मत synapses के घिराव करने की प्रक्रिया है. हमने हाल ही स्वस्थ, प्रसव के बाद माउस मस्तिष्क 7 में synaptic छंटाई के संदर्भ में इस घटना से पता चला है. विशेष रूप से , microglia, निवासी सीएनएस प्रतिरक्षा कोशिकाओं और फ़ैगोसाइट, एक चोटी की अवधि के दौरान और विकासात्मक synaptic छंटाई, चेतक की प्रसव के बाद पृष्ठीय पार्श्व जानुवत नाभिक (dLGN) के एक क्षेत्र में presynaptic आदानों अपनी चपेट में ले दिखाया गया. इस घिराव की आनुवंशिक या औषधीय नाकाबंदी synaptic संपर्क में निरंतर घाटे में हुई.इस प्रोटोकॉल में, हम presynaptic आदानों की भक्षककोशिकीय की मध्यस्थता घिराव को मापने के लिए एक विश्वसनीय और अत्यधिक मात्रात्मक परख का वर्णन. इस अनुच्छेद के प्रयोजनों के लिए, इस परख रेटिना में रहने वाले रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं शामिल है, जो विकासशील retinogeniculate प्रणाली, (RGCs) के संदर्भ में प्रस्तुत किया जाएगाdLGN (चित्रा 1 ए) के लिए presynaptic आदानों परियोजना. शुरू करने के लिए, एक lysosomal गिरावट प्रतिरोधी अग्रगामी लेबलिंग रणनीति dLGN में RGC विशेष presynaptic आदानों (चित्रा 1) 7,21 कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो वर्णन किया जायेगा. इस वर्णन, इमेजिंग के लिए एक विस्तृत कार्यप्रणाली के बाद और मात्रात्मक 3 आयामी (3 डी) सतह मात्रा प्रतिपादन के साथ संयुक्त confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग घिराव मापने दिया जाएगा. इस पद्धति तय ऊतक तैयार करने पर आधारित है, लेकिन यह भी रहते इमेजिंग अध्ययन में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. परख स्वस्थ, प्रसव के बाद retinogeniculate प्रणाली के संदर्भ में मान्य किया गया है, जबकि महत्वपूर्ण बात है,, एक अन्य मस्तिष्क भर में और बीमारी के दौरान भक्षककोशिकीय न्यूरॉन बातचीत, साथ ही अन्य अंग प्रणालियों में भक्षककोशिकीय समारोह का आकलन करने के लिए एक ही तकनीक लागू हो सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
सही phagocytosis उपाय करने के लिए, घिरा सामग्री lysosomal गिरावट आ गई है एक बार अनुसंधानकर्ता यह कल्पना कर सकते हैं कि इस तरह से लेबल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, उच्च संकल्प इमेजिंग पूरे सेल की मात्रा कल्पना और उसकी स?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
,,, एनआरएसए (डीपीएस F32-NS-066698), काम स्मिथ परिवार फाउंडेशन (बी एस), दाना फाउंडेशन (बी एस), जॉन मर्क विद्वान कार्यक्रम (बी एस), NINDS (बी एस RO1-NS-07100801) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया नैन्सी Lurie मार्क्स फाउंडेशन (डीपीएस), एनआईएच (P30-HD-18655, MRDDRC इमेजिंग कोर).
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. E., et al. The role of microglia in the healthy brain. J Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Sierra, A., et al. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Dheen, S. T., et al. Microglial activation and its implications in the brain diseases. Curr Med Chem. 14 (11), 1189-1197 (2007).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Katz, L., Shatz, C. Synaptic activity and the constuction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-1138 (1996).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Hua, J. Y., Smith, S. J. Neural activity and the dynamics of central nervous system development. Nat Neurosci. 7 (4), 327-332 (2004).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat Rev Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Butz, M., et al. Activity-dependent structural plasticity. Brain Res Rev. 60 (2), 287-305 (2009).
- Bruel-Jungerman, E., et al. Brain plasticity mechanisms and memory: a party of four. Neuroscientist. 13 (5), 492-505 (2007).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Synapse elimination during development and disease: immune molecules take centre stage. Biochem Soc Trans. 38 (2), 476-481 (2010).
- Alexander, A., et al. The complement system: an unexpected role in synaptic pruning during development and disease. Annu Rev Neurosci. 35, 369-389 (2012).
- Brown, A., Weaver, L. C. The dark side of neuroplasticity. Exp Neurol. 235 (1), 133-141 (2012).
- Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int Rev Neurobiol. 87, 483-505 (2009).
- Tan, A. M., Waxman, S. G. Spinal cord injury, dendritic spine remodeling, and spinal memory mechanisms. Exp Neurol. 235 (1), 142-151 (2012).
- Wolpaw, J. R., Tennissen, A. M. Activity-dependent spinal cord plasticity in health and disease. Annu Rev Neurosci. 24, 807-843 (2001).
- Schafer, D. P., et al. The "quad-partite" synapse: Microglia-synapse interactions in the developing and mature CNS. Glia. 61 (1), 24-36 (2013).
- Mukhopadhyay, S., et al. Manganese-induced trafficking and turnover of the cis-Golgi glycoprotein GPP130. Mol Biol Cell. 21 (7), 1282-1292 (2010).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Knobloch, M., Mansuy, I. M. Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer’s disease. Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).
- Masliah, E., et al. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).
- Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington’s disease. Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).
- Noda, M., Suzumura, A. Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis. Int J Alzheimers Dis. , (2012).
- Rotshenker, S. Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease. J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).
- Smith, M. E. Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review. Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).
