Микроглия являются резидентные иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС) с высокой способностью фагоцитозу или поглотить материал в их внеклеточной среде. Здесь широко применимы, надежный и очень количественный анализ для визуализации и измерения микроглии-опосредованной полном охвате синаптических компонентов описан.
Фагоцитоз представляет собой процесс, в котором клетка поглощает материал (вся клеток, частей клеток, мусора и т.д.) в окружающей его внеклеточной среде, а затем переваривает этот материал, как правило, через деградации лизосом. Микроглия являются резидентные иммунные клетки центральной нервной системы (ЦНС), чьи фагоцитарной функции была описана в широком диапазоне условий от нейродегенеративных заболеваний (например, бета-амилоид зазора при болезни Альцгеймера) для развития здорового мозга (например, синаптической обрезка) 1-6. Следующий протокол является охвате анализа разработан для визуализации и количественной микроглии-опосредованной полном охвате пресинаптических входов в развивающихся мыши системы retinogeniculate 7. В то время как этот анализ был использован для оценки функции микроглии в данном конкретном контексте, подобный подход может быть использован для оценки других фагоцитов по всему мозгу (например, астроцитов) и остальной частью тела(например, периферические макрофаги), а также другие условия, в которых происходит ремоделирование синапсов (например, повреждение головного мозга / болезнь).
Synaptic схемы реконструировать в течение всей жизни животного. В развивающемся мозге, синапсы образуются в избытке, и должны пройти синаптическую обрезку, которая предусматривает селективное удаление подмножества синапсов а также поддержание и укрепление этих синапсов, которые остаются 8-10. Этот процесс необходим для достижения точного характеристику подключения взрослого нервной системы. У взрослых, синапсы также может быть пластик, особенно в контексте обучения и памяти. Структурные корреляты этой пластичности, как полагают, включают в себя добавление и / или ликвидации дендритных шипиков и пресинаптических бутонов 11-13. В дополнение к этим ролям в здоровой нервной системы, синаптической ремоделирования также участвует в заболевание нервной системы / травмы 12,14,15. Например, после травмы спинного мозга, отрубленные аксоны должны впоследствии реконструировать и формировать новые синапсы для достижения функционального восстановления 16-19.
нт "> Появившись как важного аспекта синаптической пластичности является процесс фагоцитоза или охвате синапсов, предназначенных для удаления 3,5,20. Недавно мы показали это явление в контексте синаптической обрезки в здоровой, послеродовой мозга мыши 7. частности , микроглии, резиденты ЦНС иммунные клетки и фагоциты, были показаны поглотить пресинаптические входы в пиковый период и в области развития синаптической обрезки, послеродовой спинной латерального коленчатого тела (dLGN) таламуса. Генетическая или фармакологическая блокада этой охвате привело к длительным дефицитом в синаптической связи.В этом протоколе, мы описываем надежный и очень количественного анализа для измерения фагоцитов опосредованного полном охвате пресинаптических входов. Для целей настоящей статьи, этот анализ будет представлен в контексте развивающегося retinogeniculate системы, которая включает ганглиозных клеток сетчатки (РГК), проживающего в сетчатке, чтопроецировать пресинаптические вклад в dLGN (рис. 1А). Для начала, лизосомального деградации устойчивых антероградная стратегия маркировка будет описано, которая используется для визуализации RGC-специфические пресинаптические входы в dLGN (рис. 1) 7,21. После этого описания, подробной методики для работы с изображениями и количественного измерения полном охвате помощью конфокальной микроскопии в сочетании с 3 мерные (3D) поверхности объема оказания будет дано. Эта методика основана на подготовку фиксированной ткани, но также могут быть адаптированы для использования в живых визуальных исследований. Важно отметить, что в то время как анализ был подтвержден в контексте здорового, послеродовой системы retinogeniculate, можно применять те же методы для оценки других взаимодействий фагоцитов-нейронов по всему мозгу и во время болезни, а также функцию фагоцитов в других органах и системах.
Для того, чтобы точно измерить фагоцитоз, охвачен материал должен быть помечены таким образом, что исследователь может визуализировать один раз деградация лизосомальных произошло. Кроме того, высокое разрешение изображений требуется, с последующим использованием программного обесп?…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке грантов от Smith Family Foundation (BS), Дана фонда (BS), Джон Merck Ученые программы (BS), NINDS (РВЫХ1-NS-07100801; BS), НРСА (F32-NS-066 698; DPS), Нэнси Лурье Marks Foundation (ДПС), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC изображений фаза).
Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
594: C22842 | |||
647: C34778 | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
#55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |