מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם קיבולת גבוהה לphagocytose או לבלוע את חומר בסביבה תאית שלהם. הנה, assay החלים רחב, אמין, וכמותי מאוד להדמיה ומדידת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של רכיבים סינפטיים מתואר.
Phagocytosis הוא תהליך שבו תא בולע חומר (כל תא, חלקי תא, פסולת, וכו ') בסביבה תאית המקיפה אותה ולאחר מכן מעכל את החומר הזה, בדרך כלל באמצעות השפלה lysosomal. מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שphagocytic פונקציה שתואר במגוון רחב של תנאים ממחלה ניוונית של מערכת עצבים (, אישור לדוגמא בטא עמילואיד במחלת אלצהיימר) להתפתחות של המוח בריא (למשל, הסינפטי גיזום) 1-6. הפרוטוקול הבא הוא assay היבלעות פותח כדי לחזות ולכמת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של תשומות presynaptic במערכת retinogeniculate עכבר פיתוח 7. בעוד assay זה שימש להערכת תפקוד מיקרוגליה בהקשר המסוים הזה, בגישה דומה ניתן להשתמש כדי להעריך phagocytes אחר בכל רחבי המוח (למשל, האסטרוציטים) ושאר הגוף(למשל, מקרופאגים היקפיים), כמו גם בהקשרים אחרים שבהם שיפוץ הסינפטי מתרחש (למשל, פגיעה במוח / מחלה).
מעגלי Synaptic לשפץ לאורך החיים של בעלי חיים. במוח המתפתח, הסינפסות יוצרות עודפות וחייבות לעבור גיזום הסינפטי הכולל את ההסרה סלקטיבית של קבוצת משנה של סינפסות ותחזוקה וחיזוק של סינפסות אלה שנותר 8-10. תהליך זה הוא הכרחי כדי להשיג אופייני קישוריות המדויקת של מערכת העצבים הבוגרת. במבוגרים, סינפסות יכולות להיות גם פלסטיק, במיוחד בהקשר של למידה וזיכרון. הקושרת המבנית של פלסטיות זה חשב לכלול את התוספת ו / או חיסול של קוצים הדנדריטים וboutons presynaptic 11-13. בנוסף לתפקידים אלה במערכת העצבים בריאה, שיפוץ הסינפטית מעורב גם ב12,14,15 מחלה של מערכה / פציעת עצבים. כך למשל, בעקבות פגיעה בחוט השדרה, האקסונים נותקו חייבים לאחר מכן לשפץ ויוצרים סינפסות חדשות כדי להשיג 16-19 התאוששות תפקודי.
NT "> מתעוררים כהיבט חשוב של פלסטיות הסינפטית הוא התהליך של phagocytosis או היבלעות של סינפסות המיועדות להסרת 3,5,20. לאחרונה הראו תופעה זו בהקשר של גיזום הסינפטי במוח בריא, לאחר הלידה העכבר 7. באופן ספציפי , מיקרוגליה, תושב התאים חיסוניים במערכת העצבים המרכזית וphagocytes, הוצגו לבלוע תשומות presynaptic במהלך תקופת שיא ובאזור של גיזום הסינפטי התפתחותי, הגרעין לאחר הלידה הגבי לרוחב הברכיתיים (dLGN) של התלמוס. מצור גנטי או תרופתי של היבלעות זו הביא לגירעונות מתמשך בקישוריות הסינפטית.בפרוטוקול זה, אנו מתארים assay אמין וכמותי מאוד למדוד היבלעות בתיווך תא בלען של תשומות סינפטי. לענין סעיף זה, assay זה יוצג בהקשר של מערכת פיתוח retinogeniculate, הכוללת תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) המתגוררת ברשתית כיפרויקט תשומות presynaptic לdLGN (איור 1 א). כדי להתחיל, אסטרטגית תיוג lysosomal השפלה עמידה אנטרוגדית תתואר, המשמשת כדי להמחיש תשומות presynaptic RGC ספציפיות בdLGN (איור 1) 7,21. בעקבות התיאור הזה, מתודולוגיה מפורטת להדמיה ומדידת כמותית היבלעות באמצעות מיקרוסקופיה confocal בשילוב עם 3 ממדים (3D) משטח נפח טיוח יינתן. מתודולוגיה זו מבוססת על הכנת רקמה קבועה, אך עשוי גם להיות מותאמת לשימוש בבדיקות הדמיה בשידור חי. חשוב מכך, בזמן שassay אומת בהקשר של מערכת retinogeniculate בריאה, לאחר הלידה, ניתן היה להחיל את אותן טכניקות כדי להעריך אינטראקציות אחרות התא בלען נוירון בכל רחבי המוח, ובמהלך המחלה, כמו גם תפקוד תא בלען במערכות איברים אחרים.
על מנת למדוד במדויק phagocytosis, חייבים להיות מסומנים בחומרים נבלעו בצורה כזאת, כי החוקר יכול לדמיין את זה פעם אחת השפלה lysosomal התרחשה. בנוסף, נדרש הדמיה ברזולוציה גבוהה, ואחריו את השימוש בתוכנה שיאפשר לחוקר לדמיין את עוצמת הקול של כל התא ולכמת את התוכן שלה. בפרוטוקול זה, אנו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה נתמכה על ידי מענקים מקרן סמית המשפחה (BS), קרן דנה (BS), תכנית ג'ון מרק מלומדים (BS), NINDS (RO1-NS-07,100,801; BS), NRSA (F32-NS-066,698; DPS), קרן ננסי וריא מרקס (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC ההדמיה Core).
Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
594: C22842 | |||
647: C34778 | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
#55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |