貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル
Summary
小膠細胞は、それらの細胞外環境に材料を貪食又は巻き込むための高い能力を有する中枢神経系（CNS）の居住者の免疫細胞である。ここでは、シナプスのコンポーネントのミクログリア媒介貪食を可視化し、測定するために広く適用可能で信頼性が高く、高度に定量的なアッセイが記載されている。
Abstract
食作用は、細胞がその周囲の細胞外環境での材料（全体の細胞、細胞の一部、破片など）を飲み込み、その後、一般的にリソソーム分解を介して、この材料を消化する過程である。ミクログリアは、食細胞機能健康な脳（ 例えば、シナプスの開発に神経変性疾患（アルツハイマー病、例えば 、βアミロイドクリアランス）から条件の広い範囲に記載されている中枢神経系（CNS）の免疫細胞である常駐剪定）1-6。以下のプロトコルを開発し、マウスのretinogeniculateシステム7におけるシナプス前入力のミクログリア媒介貪食を可視化し、定量化するために開発された貪食アッセイである。このアッセイは、この特定の文脈においてミクログリア機能を評価するために使用されたが、同様のアプローチは、脳（ 例えば、星状細胞）、および身体の残りの部分で他の食細胞を評価するために使用され得る（ 例えば 、末梢マクロファージ）だけでなく、シナプスのリモデリングが起こる他のコンテキスト（ 例えば 、脳損傷/疾患）。
Introduction
シナプス回路は、動物の生涯を通じて改造。発達中の脳では、シナプスを過剰に形成し、シナプスのサブセットを選択的に除去し、8月10日のまま、それらのシナプスの維持·強化を伴うシナプス刈り込みを受けなければならない。このプロセスは、成体の神経系の正確な接続の特性を達成するために必要である。成人において、シナプスは、特に学習および記憶の文脈において、プラスチック製とすることができる。この可塑性の構造的な相関を、樹状突起およびシナプス前終末11-13の添加および/ または除去を含むと考えられている。健康的な神経系のこれらの役割に加えて、シナプスのリモデリングにも神経系疾患/傷害12,14,15に関与している。例えば、脊髄損傷後、切断された軸索は、その後、改造や機能回復の16〜19を実現するために新たなシナプスを形成する必要があります。
NTは">シナプス可塑性の重要な側面として浮上して、食作用または削除3,5,20宛てシナプスの飲み込みのプロセスです。我々は最近、健康で、出生後のマウス脳7におけるシナプス刈り込みのコンテキストで、この現象を示した。具体的に、ミクログリア、常駐CNS免疫細胞と食細胞は、ピーク時や発達シナプス刈り込み、視床の出生後の背側外側膝状核（DLGN）の領域において、シナプス前の入力を巻き込むことが示された。この飲み込みの遺伝的または薬理学的遮断シナプス接続の持続的な赤字となりました。このプロトコルでは、シナプス前の入力の食細胞媒介貪食を測定するための信頼性の高い、高度に定量的な分析を説明します。この記事の目的のために、このアッセイは、網膜内に存在することが網膜神経節細胞（RGC）を含む、現像retinogeniculateシステムの文脈で提示されるDLGN（ 図1A）、プロジェクトシナプス前入力。開始するには、リソソーム分解耐性順行性標識戦略はDLGNにおけるRGC特異的シナプス前入力（ 図1）7,21 を可視化するために使用される、説明する。この説明に続いて、画像化および定量3（3D）次元表面ボリュームレンダリングと組み合わせた共焦点顕微鏡を用いて貪食を測定するための詳細な方法論は説明する。この方法論は、固定組織標本に基づいているだけでなく、ライブイメージング研究での使用に適合されてもよい。アッセイは、健康な、出生後retinogeniculateシステムの文脈で検証されてきたが重要なことには、一方が他方の脳全体および疾患時の食細胞 – ニューロン相互作用、ならびに他の器官系における食細胞の機能を評価するために同じ手法を適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
正確に食作用を測定するために、飲み込ま材料がリソソーム分解が発生した後、研究者はそれを視覚化することができるようにラベル付けされなければならない。さらに、高解像度イメージングは、セル全体の体積を可視化し、その内容を定量化する研究を可能にするソフトウェアを使用し、続いて、必要とされる。このプロトコルでは、高解像度の共焦点顕微鏡および三次元再構成と?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
、、、NRSA（DPS F32-NS-066698）;作業はスミスファミリー財団（BS）、ダナ財団（BS）、ジョン·メルク奨学金プログラム（BS）、NINDS（BS RO1-NS-07100801）からの補助金によって支えられてナンシー·ルーリーマーク財団（DPS）、NIH（P30-HD-18655; MRDDRCイメージングコア）。
Materials
| Heat pad | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| Warm water source for heat pad | Kent Scientific | TP-700 | |
| Stereo microscope | DSC Optical | Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope | |
| Sliding microtome with freezing stage | Leica | SM2010 R | |
| Microtome blade | Leica | 14021607100 | |
| Fluorescent dissecting microscope | Nikon | SMZ800 with Epi-fluorescence attachment | |
| Spinning disk confocal microscope | Perkin Elmer | UltraView Vox Spinning Disk Confocal | |
| 10 µl Hamilton gas tight syringes | Hamilton | 80030 | Use a different syringe for each color dye/tracer |
| Hamilton needles | Hamilton | 7803-05, specifications: blunt, 1.5" | |
| Alexa-conjugated cholera toxin β subunit (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | Reconstitute in sterile saline, 80 µl (488), 100 µl (594), 20 µl (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-50TAB | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment) | Bausch & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 gauge needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5630 | |
| Cotton-tipped applicator | Fisher | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use in a fume hood and wear personal protective equipment. |
| Dissection tools – scissors, forceps, spatula | Small scissors: Fine Science Tools | Small scissors:14370-22 | |
| Large scissors: Roboz | Large scissors: RS-6820 | ||
| #55 forceps: Fine Science Tools | #55 forceps: 11255-20 | ||
| Spatula: Ted Pella, Inc. | Spatula: 13504 | ||
| Sucrose | Sigma | S8501-5KG | Make 30% sucrose in PBS (weight/vol) |
| OCT Compound | VWR | 25608-930 | |
| Weigh boat | USA Scientific | 2347-1426 | |
| 24-well plates | BD Biosciences | 353047 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S6566-500G | Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20. To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136-500G | |
| Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| Charged microscope slide | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
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