이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em> 제자리에서</em> 애벌레 바다 장어의 하이브리드
Summary
칠성 장어는 완전 척수 손상 후 운동을 복구 할 수 있습니다. 그러나 일부 척추 – 투사 뉴런 좋은 재생기하고 다른 사람은 없습니다. 이 문서는 완전한 척수 transections 생산 및 현장 하이브리드에 대한 wholemount 뇌와 척수를 준비, 주택 바다 칠성 장어 유생 (최근 변화 성인)에 대한 기술을 보여줍니다.
Abstract
완전 척수 손상 후 처음 바다 칠성 장어는 절개의 수준 이하로 마비된다. 그러나, 몇 주 후에 운동력을 복구하고,이 propriospinal 축삭 및 뇌간으로부터 돌출-척수 축삭의 재생 단거리 (몇 mm)을 동반한다. 36 대 식별 척추 – 투사 신경 세포 중 일부는 좋은 재생기가 있고 다른 사람은 나쁜 재생기입니다. 이 신경 세포는 쉽게 wholemount CNS 준비에 식별 할 수 있습니다. 선호하는 신경 세포 고유의 메커니즘을 이해하거나 척추 동물의 중추 신경계에 손상 후 축삭 재생을 억제하기 위해, 우리는 좋고 나쁜 재생기 간의 유전자 발현의 차이를 결정하는 방법과 표현은 척수 절개에 의해 영향을 받는다. 이 논문은 미세한 비전 아래 완전 척수 transections을 생산하고, BR을 준비하고, 신선한 물 탱크에서 주택 애벌레에 대한 기술과 최근 변화 성인 바다 칠성 장어를 보여줍니다아인 및 현장 하이브리드에 대한 척수 wholemounts. 간단히, 동물은 16로 유지됩니다 C를 °와 칠성 장어의 벨소리에 1 %의 벤조 카인에 마취. 척수 등쪽 접근 방식을 통해 홍채 절제술 가위로 가로로하고, 동물은 23 ° C에서 신선한 물 탱크에 복구 할 수 있습니다. 현장 하이브리드의 경우, 동물 reanesthetized하고 뇌와 코드가 지느러미 접근 방식을 통해 제거했다.
Introduction
포유 동물에서 척수 손상 (SCI)는 부상 축삭은 외상 영역을 통해 재생과 적절한 대상에 다시 연결하지 않기 때문에 부상의 사이트 아래 기능의 영구적 인 손실로 이어지는 치명적인 조건이다. 포유류는 달리, 칠성 장어는 완전한 척수 손상 후 운동력을 복구. 1 흥미롭게 칠성 장어 때문에 그들의 큰 크기 2,3 (도 1)의 뇌 제제 마운트 전체 36 척수에서 개별적으로 식별되어 뉴런 돌출 세트를 가지고 . 이러한 척추-돌출 뉴런은 모두 높은 수준의 완전한 척수 절개하여 axotomized된다. 우리 그룹 등의 이전의 연구는 다른 일반적으로 손상 부위를 통해 자신의 축삭을 재생하는 동안, 심지어 이러한 뉴런의 일부는 매우 낮은 재생 능력을 보여 SCI 후 기능 회복의 존재 (그들이 "나쁜 재생기를"으로 간주된다) 것으로 나타났다 (그들이 간주된다 "g짐 우드 재생기 "). 2,3이 특성은 칠성 장어에게 차례를 시도 뉴런의 고유 재생 능력의 차이로 이어질 것입니다 좋고 나쁜 재생기 척추 – 투사 신경 세포 간의 유전자 발현의 차이를 연구하는 재미있는 척추 동물 모델을 만드는 같은 외부 환경에서 축삭을 재생. 1
우리가 이전에 보여 주었다이 모델을 사용하여 척추 – 투사 각각 netrin와 RGM의 억제 작용을 매개 UNC5 4,5 및 neogenin, 6 등의 축삭지도 분자 수용체의 낮은 재생 능력 쇼 식 뉴런. 또한,이 방법을 사용하여 우리의 그룹은 단지 좋은 재생기가 손상 후 및 재생 공정 동안에 neurofilaments의 표현의 회복을 보여주는 것으로 나타났다. 최근 부시 모건 7은 나쁜 재생기가 increas를 표시하는 면역에 의해 보여 주었다"나쁜 재생기"척추 – 투사 신경 세포가 서서히 완전한 척수 절개의 5,7,8 후 사망 사실을 저자가 관련되어 부상 후 시누 클레인의 에드 표현. 그래서 완전한 척수 손상의 칠성 장어 모델은 척수 투사 신경 세포 axotomy 후 "나쁜 재생기를"무엇이 이해하는 매우 유용한 모델로 등장했다.
우리는 현장 하이브리드 화에 wholemount 수행 손상 후 원하는 시점에서 완전한 척수 절개 수술 프로토콜과 후방 뇌 해부를 수행하는 우리의 연구를 수행합니다. 본 방법론 기사에서 우리는 애벌레 칠성 장어의 완전 척수 손상 수술의 적절한 성능에 대한 자세한 프로토콜을 제시, 동물의 후속 유지 보수 및 현장 하이브리드 화에 wholemount에 대한 최종 뇌의 해부 및 뇌의 준비. 자세한 프로토콜 퍼가기합니다유생 칠성 장어의 뇌에서 원위치 혼성화 wholemount을 rform는 이전에보고 된 바있다. 9는 또한, 척수 손상 및 뇌 해부 본 프로토콜은 또한 다음, 면역 조직 화학 또는 다른 조직 학적 방법에 대한 뇌를 처리하는 데 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 애벌레 바다 칠성 장어의 완전 척수 절개 후방 뇌 해부를 수행하기 위해 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 원위치 혼성화에 전체 실장 뇌에 의한 척수 손상 후 척수 식별 돌출 뉴런 간의 유전자 발현의 차이를 분석한다. 절차에서 중요한 단계는 부드럽게 한 쌍의 유충의 주둥이를 터치하여 24 시간 후 stereomicrocope 하에서 척수의 절단 단부를 관찰함으로써 제어되고 확인 될 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
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