إصابة الحبل الشوكي الكامل وبروتوكول تشريح الدماغ لاحقا Wholemount<em> في الموقع</em> التهجين في اليرقات البحر الجلكى
Summary
Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.
Abstract
بعد اصابة كاملة في النخاع الشوكي، والشلل الأنقليس البحر في البداية دون مستوى transection. ومع ذلك، فإنها استعادة تنقل بعد عدة أسابيع، وهذا يرافقه تجديد مسافة قصيرة (بضعة ملم) نخاعي مخصوص من المحاور والمحاور إسقاط العمود الفقري، من جذع الدماغ. بين 36 الخلايا العصبية في العمود الفقري إسقاط-تعريفية كبيرة، وبعضها regenerators جيدة والبعض الآخر سيئة regenerators. يمكن بسهولة تحديد هذه الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الاستعدادات wholemount. من أجل فهم الآليات العصبية الجوهرية التي تحول دون محاباة أو محوار تجديد بعد إصابة في الجهاز العصبي المركزي الفقاريات، نحن تحديد الاختلافات في التعبير الجيني بين regenerators الجيدة والسيئة، وكيف يتأثر التعبير transection الحبل الشوكي. وتوضح هذه الورقة تقنيات اليرقات الإسكان وتحولت مؤخرا الأنقليس البحر الكبار في خزانات المياه العذبة، وإنتاج كاملة transections الحبل الشوكي تحت الرؤية المجهرية، وإعداد رعين وwholemounts الحبل الشوكي لالتهجين في الموقع. باختصار، يتم الاحتفاظ الحيوانات في 16 ° C وتخدير في 1٪ بنزوكاين في الجلكى قارع الأجراس. ومقطوع الحبل الشوكي مع مقص قطع القزحية عبر نهج الظهرية ويسمح للحيوان لاسترداد في خزانات المياه العذبة في 23 درجة مئوية. لالتهجين في الموقع، وreanesthetized الحيوانات والدماغ والحبل إزالة عبر نهج الظهرية.
Introduction
في الثدييات إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هو شرط المدمرة التي تؤدي إلى فقدان دائم للوظيفة تحت موقع الإصابة لمحاور جرح لا تتجدد من خلال منطقة الصدمة وإعادة الاتصال إلى أهدافهم المناسبة. على عكس الثدييات، الأنقليس التعافي تنقل بعد إصابة الحبل الشوكي كاملة. 1 ومن المثير للاهتمام، الأنقليس لديها مجموعة من 36 الحبل الشوكي إسقاط الخلايا العصبية التي يمكن تحديدها بشكل فردي في جبل لالجامع الاستعدادات الدماغ بسبب حجمها الكبير 2،3 (الشكل 1) . وaxotomized كل من هذه الخلايا العصبية في العمود الفقري عن طريق إسقاط كامل transection الحبل الشوكي على مستوى عال. وقد أظهرت الدراسات السابقة من مجموعتنا وآخرون أنه حتى في وجود الانتعاش وظيفية بعد اصابات النخاع الشوكي بعض هذه الخلايا العصبية تظهر قدرة التجدد منخفضة جدا (أنها تعتبر "regenerators سيئة")، في حين أن آخرين تتجدد عادة محور عصبي من خلال موقع الإصابة (أنها تعتبر "زregenerators العود "). 2،3 هذه الخاصية تجعل الأنقليس نموذجا الفقاريات مثيرة للاهتمام لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني بين الاسترجاع الجيد والسيئ إسقاط الخلايا العصبية في العمود الفقري والتي بدورها سوف تؤدي إلى اختلافات في القدرة على التجدد من الخلايا العصبية الذاتية التي تحاول تجديد محاور عصبية في نفس البيئة خارجي. 1
باستخدام هذا النموذج أظهرنا سابقا أن الخلايا العصبية مع انخفاض القدرة على التجدد المعرض التعبير عن مستقبلات الجزيء التوجيه محور عصبي مثل UNC5 4،5 وneogenin، 6 الذي توسط في العمل المثبطة من netrin وRGM التوالي إسقاط العمود الفقري. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام هذا الأسلوب وقد أظهرت مجموعتنا أيضا أن فقط regenerators جيدة تظهر انتعاشا للتعبير عن neurofilaments بعد إصابة وأثناء عملية التجدد. مؤخرا، أظهرت بوش ومورغان 7 بواسطة المناعي أن تظهر regenerators سيئة على الزيادهإد التعبير عن synuclein بعد الإصابة، التي ارتبط بها الكتاب إلى حقيقة أن "المجداد سيئة" إسقاط الخلايا العصبية في العمود الفقري يموتون ببطء بعد استكمال الحبل الشوكي transection 5،7،8. لذلك، برز نموذج الجلكى اصابة في الحبل الشوكي كاملة كنموذج مفيد جدا لفهم ما يجعل الحبل الشوكي والخلايا العصبية إسقاط "المجداد سيئة" بعد axotomy.
لإجراء دراسات لدينا ونحن أداء كاملة الشوكي transection الحبل بروتوكول جراحة وتشريح الدماغ الخلفي عند نقاط الوقت المطلوب بعد إصابة لأداء wholemount التهجين في الموقع. في المقالة المنهجية الحالية نقدم بروتوكول مفصلة عن الأداء السليم لعملية جراحية في العمود الفقري إصابة الحبل كاملة في الأنقليس اليرقات، وصيانة لاحقة من الحيوانات وتشريح الدماغ النهائي وإعداد الدماغ لwholemount التهجين في الموقع. بروتوكول مفصل لPErform على wholemount في الموقع التهجين في الدماغ من الأنقليس اليرقات وقد ذكر سابقا. 9 وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا البروتوكول لإصابة الحبل الشوكي وتشريح الدماغ يمكن أن تستخدم أيضا ثم لمعالجة أدمغة لالمناعية النسيجية أو أساليب أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we present a detailed protocol to perform a complete spinal cord transection and posterior brain dissection in larval sea lampreys. This procedure allows analyzing differences in gene expression between identifiable spinal cord projecting neurons after spinal cord injury by means of a whole-mount brain in situ hybridization. The critical step in the procedure is the correct performance of a complete spinal cord transection, which can be controlled by observing the cut ends of the spinal cord under the stereomicrocop…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R., McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neurosciences. 90, 957-965 (1999).
