その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em>その場で</em>幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション
Summary
ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復する。しかし、いくつかの脊髄投射ニューロンが良い再生器であり、そうでないものもあります。本稿では、完全な脊髄離断を生成し、in situハイブリダイゼーションのためのホールマウントの脳や脊髄の準備、住宅海ヤツメウナギの幼生（最近変換された大人）のための手法を例示する。
Abstract
完全な脊髄損傷後、最初は海のヤツメウナギは離断のレベル以下に麻痺している。しかし、これらは数週間後に歩行をリカバリし、これを脊髄固有の軸索および脳幹から脊髄に突出する軸索の短い距離再生（数mm）を伴う。 36大の識別可能脊髄投射ニューロンの中には、優れた再生器であり、他は悪い再生器である。これらのニューロンは、最も容易にホールマウントCNS調製物中で同定することができる。有利ニューロン固有のメカニズムを理解または脊椎動物CNSにおける損傷後の軸索再生を阻害するためには、良い、悪い再生器との間の遺伝子発現の相違を決定する方法、および発現は、脊髄切断によって影響される。本稿では、顕微鏡のビジョンの下で、完全な脊髄離断を生産、住宅幼虫のための技術と新鮮な水タンク内の最近変換された大人の海のヤツメウナギを示しており、BRの準備AINおよびin situハイブリダイゼーションのための脊髄wholemounts。簡単に述べると、動物を16に維持される C°、ヤツメウナギリンガーで1％ベンゾカインで麻酔し。脊髄は背側アプローチを介して、虹彩切除鋏で切開され、動物は23℃の真水タンクに回復させる。 in situハイブリダイゼーションのために、動物を再麻酔され、脳と脊髄は背側アプローチを介して除去。
Introduction
哺乳動物では、脊髄損傷（SCI）は、負傷した軸索がトラウマゾーンを通って再生し、それらの適切なターゲットに再接続していないため、損傷部位以下の機能の永久的な損失につながる壊滅的な条件である。哺乳類とは対照的に、ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復。1興味深いことに、ヤツメウナギは、それらの大きなサイズのホールマウント脳調製物において個別に識別可能なニューロンを投影する36脊髄のセットを持っている2,3（ 図1） 。これらの脊髄投射ニューロンのすべてが高レベルの完全な脊髄離断により軸索切断されている。私たちのグループとその他の以前の研究では、他の人は通常、損傷部位を通じて軸索を再生しながらでも、これらのニューロンのいくつかは非常に低い再生能力を示し、SCI後の機能回復の存在下で、（彼らは "悪い再生器を」と考えられている）ことを示している（それらが考慮される「グラムOOD再生器」）。2,3この特性は、ヤツメウナギ面白い脊椎動物モデルは今度にしようとする神経細胞の本質的な再生能力の違いにつながる良い面と悪い蓄冷脊髄投射ニューロン間の遺伝子発現の違いを研究することができます同じ外因環境での軸索を再生。1
このモデルを用いて、私たちは、以前にそれぞれネトリンとRGMの阻害作用を媒介しUNC5 4,5及びネオゲニンなどの軸索ガイダンス分子レセプターの低い再生能力を示して発現とその脊髄投射ニューロン、6を示している。また、この方法を使用することによってわれわれのグループはまた、唯一の良い再生器は、損傷後、再生プロセス中にニューロフィラメントの発現の回復を示すことが示されている。最近では、ブッシュとモーガン7が悪い再生器がincreasを示すことが免疫蛍光によって示されている「悪い再生器「脊髄投射ニューロンはゆっくりと完全な脊髄離断5,7,8の後に死亡するという事実に著者によって関係している傷害後シヌクレインのエド式。だから、完全な脊髄損傷のヤツメウナギモデルは、脊髄に突出ニューロン軸索切断後に「悪い再生器 "を作るかを理解するために非常に有用なモデルとして登場しました。
私たちの研究を実施するために、本 発明者らは、in situハイブリダイゼーションホールマウントを実行するために、損傷した後、所望の時点で完全な脊髄離断手術プロトコルと後方脳の解剖を行っている。現在の方法論的な記事では、幼虫ヤツメウナギにおける完全な脊髄損傷の手術の適正なパフォーマンスのために詳細なプロトコルを提示し、動物のその後のメンテナンスやin situハイブリダイゼーションホールマウントのための最終的な脳の解剖と脳の準備。 PEに詳細なプロトコル幼虫ヤツメウナギの脳においてin situハイブリダイゼーションホールマウントをrformは、以前に報告されている。9はまた、脊髄損傷および脳の解剖のためのこのプロトコルは、その後、免疫組織化学または他の組織学的方法のために脳を処理するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、幼虫の海のヤツメウナギで完全な脊髄離断および後脳の解剖を実行するために詳細なプロトコルを提示する。この手順では、in situハイブリダイゼーションホールマウント脳による脊髄損傷後のニューロンを投影する識別可能な脊髄の間の遺伝子発現の差を分析することができる。手順における重要なステップはstereomicrocope下、脊髄の切断端を観察することによって制御され、穏や…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
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