Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling
Summary
Microfluidic jetting mot en dråpe grensesnitt lipidbilag som gir en pålitelig måte å generere vesikler med kontroll over membranen asymmetri, inkorporering av transmembrane proteiner, og innkapsling av materialet. Denne teknikken kan brukes til å studere en rekke biologiske systemer hvor compartmentalized biomolekyler er ønsket.
Abstract
Bottom-up syntetisk biologi presenterer en ny tilnærming for å undersøke og rekonstituere biokjemiske systemer og, potensielt, minimal organismer. Dette nye feltet engasjerer ingeniører, kjemikere, biologer, og fysikere til å designe og sette sammen grunnleggende biologiske komponenter til komplekse, fungerende systemer fra bunnen opp. Slike bottom-up-systemer kan føre til utvikling av kunstige celler for fundamentale biologiske henvendelser og innovative behandlings 1,2. Giant unilamellære vesikler (Guvs) kan tjene som en modell plattform for syntetisk biologi på grunn av deres celle-lignende membran struktur og størrelse. Microfluidic jetting, eller microjetting, er en teknikk som gjør det mulig for den generasjonen av Guvs med kontrollert størrelse, membran sammensetning, transmembrane protein innlemmelse, og innkapsling tre. Det grunnleggende prinsipp for denne metode er bruken av flere, høyfrekvente fluid pulser generert av en piezo-aktivert blekkskriverenhet for å deformere en suspendert lipid dobbeltlag inn et GUV. Prosessen er som å blåse såpebobler fra såpefilm. Ved å variere sammensetningen av boble løsning, sammensetningen av det omfatter løsning, og / eller de komponenter som inngår i dobbeltlaget, kan forskere anvende denne teknikk for å lage tilpassede vesikler. Dette notatet beskriver fremgangsmåten for å generere enkle vesikler fra en dråpe grensesnitt dobbeltlag ved microjetting.
Introduction
Det er blitt stadig klarere at cellebiologi er en multi-skala problem som innebærer å integrere vår forståelse fra molekyler til cellene. Derfor vet nøyaktig hvordan molekyler arbeider individuelt er ikke tilstrekkelig til å forstå komplekse cellulære atferd. Dette er delvis på grunn av eksistensen av emergent atferd av flerkomponentsystem, eksemplifisert ved tilberedning av aktin nettverk interaksjon med lipidbllag vesikler 4, mitotisk spindelenheten i Xenopus trekke ut fem, og romlige dynamikken i bakterie celledeling machineries seks. En måte å utfylle reduksjonistisk tilnærming for å dissekere den molekylære prosesser i levende systemer er å ta motsatt tilnærming av rekonstituering cellulære atferd ved hjelp av et minimalt sett av biologiske komponenter. En kritisk del av denne tilnærmingen innebærer pålitelig innkapsling av biomolekyler i et begrenset volum, en viktig funksjon i en celle.
e_content "> Flere strategier finnes for å innkapsle biomolekyler for å studere biomimetic systemer. Den mest biologisk relevant system er lipidbilag membraner, som etterligner de biokjemiske og fysiske begrensninger pålagt av cellens plasmamembran. Dannelse av gigantiske unilamellære vesikler (Guvs) ved electroformation 7, en av de mest brukte metoder for GUV generering 14, har typisk en innkapsling dårlig utbytte på grunn av sin uforenlighet med høy saltbuffer 8. Electroformation krever også store prøvevolumer (> 100 ul), som kan være et problem for å arbeide med rensede proteiner og ineffektivt omfatter store molekyler på grunn av vanskeligheten med diffusjon mellom tett plasserte lipid lag. microfluidic flere tilnærminger for å generere lipidvesikler har blitt utviklet. Dobbelt emulsjon metoder, som passerer gjennom komponentene to grenseflater mellom lag vann-olje-vann (W / O / W), er avhengig av fordampning av et volatile løsemiddel å kjøre lipidbilag formasjon 9. Andre har brukt en mikrofluidsamlebåndet som frembringer en kontinuerlig strøm av lipid-dobbeltlag-vesikler 10 eller i to uavhengige trinn 11. Vi har utviklet en alternativ teknikk basert på hurtig påføring av fluid pulser mot en dråpe grensesnitt bilayer 12 for å produsere Guvs av kontrollert størrelse, sammensetning og innkapsling. Vår tilnærming, kjent som microfluidic jetting, tilbyr de samlede fordeler fra flere eksisterende vesikkel generasjon teknikker, som gir en tilnærming for å skape funksjonelle biomolekylære systemer for å undersøke en rekke biologiske problemer.Protocol
Representative Results
Discussion
Mange teknikker har blitt utviklet for vesikkel generering, inkludert electroformation, emulsjon, og dråpe generering 14-16. Imidlertid, nye eksperimentelle teknikker er nødvendige for å muliggjøre utforming av biologiske systemer med økende likhet med levende systemer. Microfluidic metoder i særdeleshet har tilbudt en økt grad av kontroll styrende membran unilamellarity, monodispersity av størrelse, og interne innholdet 17,18, bringe vesikel modeller nærmere biologi. Videre har karakteris…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mike Vahey fra Fletcher Lab ved University of California, Berkeley for råd om microjetting parametere. Dette arbeidet ble sponset av NIH stipend DP2 HL117748-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1ml syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8" Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | Home made | N/A | CAD designs are available upon request |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
