שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם
Summary
הקמת מערכות עיקריות של רירית הרחם סטרומה תא תרבות מדגימות כריתת רחם היא טכניקת ערך ביולוגית וצעד חיוני לקראת רודף מגוון רחב של מחקר שואף. כאן, אנו מתארים שתי שיטות המשמשות להקמת תרבויות סטרומה מרקמות של רירית הרחם שעברו כריתה כירורגית של חולים אנושיים.
Abstract
מאמצים רבים הוקדשו להקמת מערכות בתרבית תאים במבחנה. מערכות אלה נועדו לבנות מודל של מספר עצום של in vivo תהליכים. מערכות תרבית תאים הנובעות מדגימות של רירית הרחם אדם אינן יוצאי דופן. יישומים נעים בין תהליכים פיסיולוגיים מחזוריים רגילים לפתולוגיות של רירית הרחם כגון סרטן גינקולוגיות, מחלות זיהומיות, וליקויי פוריות. כאן, אנו מספקים שתי שיטות להקמת תאי סטרומה רירית הרחם עיקריים מדגימות כריתת רחם רירית הרחם שעברו כריתה בניתוח. השיטה הראשונה מכונה "שיטת הגירוד" ומשלבת גירוד מכאני באמצעות סכין כירורגית או גילוח ואילו בשיטה השנייה נקראת "שיטת טריפסין." שיטה זו האחרונה משתמשת בפעילות האנזימטית של טריפסין כדי לקדם את ההפרדה של תאים והעיקריים תא תולדה. אנו מדגימים המתודולוגיה צעד אחר צעד באמצעות תמונות ומיקרוסקופ דיגיטליים. אנחנו גם providדוגמאות דואר לאימות שורות תאי סטרומה רירית הרחם באמצעות תגובות כמותיים בזמן אמת שרשרת פולימרז (qPCR) וimmunofluorescence (IF).
Introduction
קורפוס הרחם האנושי מורכב משלוש שכבות, perimetrium (או serosa), myometrium, ורירית הרחם. הבחנה כל אחת משכבות אלה הוא צעד חשוב להקמת שורות תאים של רירית הרחם. Perimetrium הוא רוב השכבה החיצונית של הרחם ומורכב של תאים דקים, הצפק. Myometrium הוא השכבה העבה, באמצע של הרחם ומורכב מתאי שריר חלק. רירית הרחם מזוהה כשכבה הפנימית של הרחם וכולל אוכלוסיות האפיתל ותאים סטרומה.
רירית הרחם הוא מחולק חלוקה נוספת לשכבת basalis גזע שאוכלוסיית תאי השערה היא לאכלס מחדש את שכבת functionalis בערך כל 28 ימים 1. שכבת functionalis של רירית הרחם האנושית עוברת שינויים ביוכימיים ומורפולוגיים משמעותיים בתגובה למחזור הורמונים. הורמונים אלה נגזרים מבלוטת יותרת המוח והשחלות.
ייצור מתואם ופרסום תוצאות הורמונים במחזור רבייה. מחזור הרבייה נועד להכין את רירית הרחם לאירועי השרשת עובר פוטנציאליים. בבני אדם, מחזור הרבייה ידוע בשם "המחזור החודשי" ומחולק לשלושה שלבים – שגשוג, הפרשה, ווסת. שלב השגשוג כרוך ההתפשטות של שכבת רירית הרחם functionalis ואילו שלב ההפרשה מתאפיין בהבשלת functionalis. באופן ספציפי, שינויים תאיים, הפרשות, והתמיינות תאים לאותת השתלה פוטנציאלית. אם השתלה אינה מתרחשת לפני תום שלב ההפרשה, שכבת רירית הרחם functionalis נשפכה במהלך שלב הווסת. חשיבותה של וסת והאירועים המפעילים את שפיכת שכבת functionalis הם עדיין נדונה. בבני אדם, זה כבר מציב כי וסת היא התוצאה של אירוע אמצע הפרשה בידול שלב מסוים ידועכ" decidualization הספונטני "2. בכתב יד זה, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לשתי שיטות בידוד תא סטרומה רירית הרחם, ולהשתמש בשילוב של immunofluorescence ותמונות דיגיטליות להדגים את היעילות של גישות אלה. בנוסף, אנו מיישמים את השימוש נפוץ במודל חוץ גופית של decidualization הספונטני כדי לאשר בידוד תא סטרומה רירית הרחם.
Protocol
Representative Results
Discussion
קבוצות אחרות שתיארו והותאמו המתודולוגיה להכנת תרבויות סטרומה רירית הרחם, שרובם לנצל collagenase 4,12,13,15-18. בכתב היד הזה, שאנו מספקים מתודולוגיה וראיות לשתי שיטות עיקריות פשוטות של רירית הרחם תרבות סטרומה, אשר שניהם מנוצלים על ידי המעבדה שלנו מסיבות כלכליות והזמינות ה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למאמצים המשותפים של ד"ר Thao דאנג וחברי המעבדה שלה לשימוש בציוד ההדמיה ומיקרוסקופ. אנו מודים גם Biorepository ומתקן רקמות מחקר ליבה (BTRF), ג'ף הרפר, והתושבים באוניברסיטת וירג'יניה שספק לנו רקמת רחם. אנו מודים קרול ה"שלאכטה לעזרה עם סכמטי סקירה.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
References
- Heller, D., Heller, D. . in The endometrium: a clinicopathologic approach. , 56-75 (1994).
- Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
- Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
- Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
- Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
- Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
- Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
- Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
- Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
- Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
- Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
- Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
- Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
- Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
- Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
- Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
- . . American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , (2013).
- Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).
