Два Методы Создание первичных клеток человека эндометрия стромальных от гистерэктомии образцов
Summary
Создание первичных эндометрия системы стромальных клеточных культур от гистерэктомии образцов является ценным биологическим техника и решающим шагом до проводит широкий спектр исследований направлена. Здесь мы описываем два методы, используемые для установления стромальных культур из хирургически удаленных эндометрия тканях больных людей.
Abstract
Много усилий было посвящено установить в пробирке системах клеточных культур. Эти системы предназначены для моделирования огромное количество естественных условиях процессов в. Клеточные культуры системы, вытекающие из эндометрия образцов человека не являются исключением. Область применения простирается от нормальных циклических физиологических процессов в эндометрии патологий, таких как гинекологического рака, инфекционных заболеваний, а также репродуктивных недостатков. Здесь мы предоставляем два метода для создания первичных эндометрия стромальных клеток из хирургически удаленных эндометрия гистерэктомии образцов. Первый метод называют "методом очищающего" и включает в себя механическое выскабливание с помощью хирургических или бритвенных лезвий в то время как второй метод называют "метод трипсин". Этот последний метод использует ферментативную активность трипсина, чтобы способствовать отделению клеток и первичных клетки вырост. Проиллюстрируем шаг за шагом методологии с помощью цифровых изображений и микроскопии. Мы также Providпримеры е для проверки эндометрия линии стромальных клеток с помощью количественных реального времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) и иммунофлюоресценции (ИФ).
Introduction
Человеком матки корпус состоит из трех слоев, в периметрий (или серозной), миометрия и эндометрия. Отличительные каждый из этих слоев является важным шагом для установления эндометрия клеточных линий. Периметрий является самой внешней слой матки и состоит из тонких, серозных клеток. Миометрия является толстый, средний слой матки и состоит из гладкомышечных клеток. Эндометрий идентифицируется как внутреннего слоя матки и включает эпителиальные и стромальных клеток населения.
Эндометрий далее подразделяется в базального слоя которого стволовых клеток населения Предполагается для повторного заполнения functionalis слой примерно каждый 28 дней 1. Functionalis слой человеческого эндометрия претерпевает значительные биохимические и морфологические изменения в связи с циркулирующих гормонов. Эти гормоны являются производными от гипофиза и яичников.
координирует производство и выброс гормонов приводит к репродуктивного цикла. Репродуктивный цикл предназначен для подготовки эндометрия для потенциальных событий имплантации эмбриона. У людей, репродуктивный цикл известен как "менструального цикла" и делится на три этапа – пролиферативная, секреторных и менструальных. Пролиферативная фаза включает в себя пролиферацию functionalis эндометрия слоя в то время как секреторная фаза отмечена functionalis созревания. В частности, внеклеточные изменения, выделениями и клеточная дифференцировка сигнал потенциального имплантации. Если имплантация не происходит до конца секреторную фазу, functionalis эндометрия слой пролить в течение менструального фазы. Важность менструации и событий, которые вызывают пролития на functionalis слоя все еще обсуждаются. В организме человека он был поставлен что менструации является результатом конкретного события середины секреторную фазу дифференцировки известнойкак "спонтанное decidualization" 2. В этой рукописи, мы предоставляем подробную методологию для обеих эндометрия методов изоляции стромальных клеток, и использовать комбинацию иммунофлюоресценции и цифровых изображений, чтобы продемонстрировать эффективность этих подходов. Кроме того, мы применяем обычно используют искусственное модели спонтанного decidualization для подтверждения изоляции эндометрия стромальных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Другие группы описали и адаптированы методологии для подготовки эндометрия стромальных культур, большинство из которых используют коллагеназы 4,12,13,15-18. В этой рукописи, мы обеспечили методику и доказательства в течение двух упрощенных первичных стромальных эндометрия методов ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим совместные усилия доктора Тао Данг и членов своей лаборатории за использование их изображений и микроскопа оборудования. Мы также благодарим Biorepository и тканей исследований фонда (BTRF) основной, Джефф Харпер и жителей в университете Вирджинии за предоставление нам ткани матки. Мы благодарим Karol шляхты за помощь с схематический обзор.
Materials
| 0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin | Hyclone | SH3023602 or SH30004202 | |
| 1.7 micro Centrifuge Tube | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1µl,20µl, 200ml and 1000µl Pipette | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15ml Conical Tube | Hyclone | 339650 | |
| 50ml Conical Tube | Hyclone | 339652 | |
| 6cm Cell Culture Dish | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 well Chambers | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Acetate | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT Enzyme/Buffer | Bio Labs | M077L | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| Buffered Zinc Formalin | Thermo | 59201ZF | |
| Charcoal strip FBS | Fisher | NC9019735 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Cover slip | Fisher Brand | 12-544D | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/High Glucose | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| Donkey Anti Goat -TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| Donkey Serum | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin Antibody | Epitomics | 1702-1 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH Probe | Life Technologies | HS99999905 | |
| Glycogen | 5Prime | 2301440 | |
| Goat Anti Mouse -FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Medroxyprogesterone acetate (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (Methanol) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| Mounting Media (w/DAPI) | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA Oligos | Invitrogen | ||
| Number 15 Scraper | BD | 371615 | |
| Pan Cytokeratin Mouse mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML Anti Goat Anti body | Santa Cruz | SC-9862 | |
| Primer(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (Phenol free) | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin Antibody | Epitomics | 4211-1 |
References
- Heller, D., Heller, D. . in The endometrium: a clinicopathologic approach. , 56-75 (1994).
- Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
- Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
- Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
- Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
- Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
- Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
- Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
- Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
- Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
- Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
- Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
- Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
- Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
- Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
- Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
- Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
- . . American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , (2013).
- Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).
