Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
De studie van het centrale zenuwstelsel (CZS) rijping is gebaseerd op genetische doelgerichtheid van neuronale populaties. Echter de taak van de expressie van genen van belang specifieke neuronale subtypes beperkt opmerkelijk moeilijk gebleken vanwege de relatieve schaarste aan specifieke promotor elementen. GABA-erge interneuronen vormen een neuronale populatie met uitgebreide genetische en morfologische diversiteit. Sterker nog, meer dan 11 verschillende subtypes van GABA-erge interneuronen gekarakteriseerd in de muis cortex 1. Hier geven we een geschikt protocol voor het selectief richten van GABAerge populaties. We bereikten subtype selectieve targeting van GABAerge interneuronen door de enhancer element van het homeobox transcriptiefactoren Dlx5 en Dlx6, homologen van het Drosophila distale minder (Dll) gen 2,3, om de expressie van specifieke genen rijden door in utero elektroporatie.
Introduction
Het grootste deel van de corticale GABAergische interneuronen zijn afkomstig van twee tijdelijke embryonale structuren genaamd de mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE respectievelijk) 4. Parvalbumine en somatostatine uiten interneuronen hun oorsprong in de MGE terwijl calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) en Reelin (Re) uiten interneuronen zijn afkomstig uit de CGE. Deze interneuron subtypen kunnen worden onderscheiden door hun geboortedata. MGE afgeleide subtypen zijn geboren tussen embryonale dag 9.5 (E9.5) en E16.5 5,6. In tegenstelling, zijn CGE afgeleid interneuronen geboren uit E12.5 door E18.5 met hun productie een piek van E15.5 6. De genetische targeting van dit late geboren bevolking blijft echter ongrijpbaar.
Het murine distale minder (Dlx) genen exclusief tot expressie in de ontwikkeling ventrale voorhersenen 3. GABA-erge interneuronen en striatum projectie neuronen maar niet corticale piramidale cellen brengen Dlx1, 2,5, en 6 genen in de vroege ontwikkelingsstadia 3. Inderdaad, de Dlx genen die in de MGE en CGE subventriculaire zone (SVZ) in alle GABAerge voorlopers. Expressie van deze genen wordt beperkt tot subtypen te selecteren op postmitotische stadia 7-9. Vorige experimenteel bewijsmateriaal bleek dat de Dlx5 / 6 versterkend element zorgt voor de selectieve targeting van GABAergic geslachten in transgene muismodellen 2. We testten het gebruik van een van deze enhancer elementen in de context van episomale expressie in de zich ontwikkelende hersenen van muizen. We sub gekloneerd de Dlx5 / 6 enhancer element met een minimale promotor en versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) in een Bluescript-(BS) backbone plasmide (Figuur 1). We introduceerden het plasmide door middel van in utero elektroporatie op E15.5 om selectief richten Cr-, VIP en Re- subtypes 3,8,10. De techniek maakt sparse elektroporatie, welke vergemakkelijktde reconstructie van de morfologische kenmerken van singe cellen. Bovendien, de uitzonderlijk hoge niveaus van genexpressie in corticale GABAerge neuronen zorgt voor functionele studies. Voerden we verlies en winst van functie studies met behulp van verschillende wild-type en dominant negatieve genen 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beperkingen van de Techniek
Hoewel deze techniek maakt cell autonome analyse van celprocessen, is het niet geschikt voor populatie-analyse. De electroporations zijn erg schraal minder dan duizend cellen geëlektroporeerd per hersenen. Bijgevolg kan de techniek niet worden gebruikt om gedragsconsequenties gevolg van de genetische manipulatie van CGE-afgeleide interneuronen beoordelen.
Terwijl electroporations uitgevoerd op E13.5-E14.5 doel MGE-afgeleide subtypen, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor Lihong Yin voor technische ondersteuning. NVD is een ontvanger van een NARSAD Young Investigator Award en wordt ook ondersteund door subsidies van de NIH (5 K99 MH095825-02). Onderzoek in de Fishell lab wordt ondersteund door het National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) en de Simons Foundation.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
