ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em>シロイヌナズナ</em
Summary
私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。
Abstract
植物の開花では、体への生殖細胞の運命遷移は大人の植物の花器官における胞子母細胞（SMC）の仕様でマークされています。女性のSMC（大胞子母細胞、MMC）は胚珠原基に区別し、減数分裂を受ける。選択された一倍体大胞子は、その後一緒にアクセサリー細胞と、配偶子を生じるであろう多雌性配偶体、卵細胞と中央のセルを形成するために、有糸分裂を受ける。胚珠内部MMC、減数分裂細胞と雌性配偶体の限られたアクセス性細胞学的および細胞遺伝学的ための技術的に困難である単一細胞レベルで分析する。特に、携帯電話または核エピトープの直接的または間接的な免疫が植物細胞および単一細胞イメージング内部の試薬の貧弱な浸透によって損なわれては、ホールマウント組織における光学的透明性の欠如によってdemisedされる。
そこで、NUCLを分析する効率的な方法を開発したホールマウント組み込みシロイヌナズナ胚珠内の単一のセルの高解像度で耳の組織とクロマチン修飾。これは、顕微鏡スライド上のアクリルアミドゲルの薄層内の固定胚珠の解剖と埋め込みに基づいています。埋め込まれた胚珠は、免疫染色試薬、組織の透明度および透過性を向上させることを目指した化学的および酵素的処理に供される。これらの治療は、細胞のクロマチン組織、DNAおよびタンパク質のエピトープを保持します。サンプルは、クロマチン免疫染色、in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光 、およびヘテロクロマチンの解析のためのDNA染色を含む種々の下流の細胞学的分析のために使用することができる。 3D再構成に続いて、高解像度の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）イメージングは、単細胞の解像度で定量的な測定を可能にする。
Introduction
顕花植物では、生殖系統の確立は、SMCの分化、女性MMCおよび男性の胞子母細胞から始まります。 MMCは胚珠原基の遠位先端のサブ表皮珠心細胞から発達し、小胞子母細胞は、深い花器官1の内部に配置されている葯房に胞子形成組織から開発しています。平滑筋細胞は、その後、有糸分裂の際に配偶体を生じる一倍体胞子を生成する減数分裂を受ける。雌性配偶体、または胚嚢は、1卵細胞、1中央のセル、2助細胞と3 antipodalsで構成されています。雄性配偶体または花粉は一つの栄養細胞二つ精子細胞から構成されている。雄性配偶体は、比較的アクセス可能なオブジェクト·オブ·研究したまま雌性配偶体が胚珠内に埋め込まれ、それ自体が花の心皮で囲まれ、したがって、分子·細胞学的分析に固有の課題を提起する。しかし、近年、レーザ支援マイクロダイセクションは、トランスクリプトームは、MMCと女性の配偶体細胞2-4で分析することができ、エレガントなソリューションを提供しました。候補遺伝子の発現に加えてin situハイブリダイゼーションまたはレポーター遺伝子アッセイにおいて、例えば RNAを用いて、分析において、細胞学的分析は、特定の直接的な細胞染色または間接的な免疫染色を用いて内因性の細胞成分の動態を調査することができる。特に、一緒にクロマチンの修正やクロマチンの構成要素の免疫染色で、魚やDNAの染色を用いて細胞遺伝学的染色は、 シロイヌナズナ 5クロマチン動態と核組織を解明するための中心的なアプローチである。一般的に、減数分裂がよく、植物の雄減数母細胞6,7で検討されている特定の染色体動態を伴う。おそらく動的なエピジェネティックなリプログラミングを反映し、さらに大規模、細胞特異的なクロマチン再編成は、花粉の発達8月10日の間に記載されている。これとは対照的に、原因女性の減数分裂細胞と配偶体の相対的な到達不能に、これらの調査は、適用が技術的に困難で残っており、多くの場合（下記参照）切片または手動切開および酵素消化を必要とする。また、全体のマウントで光学的透明度の欠如は、優勢無傷胚珠の生殖細胞の高分解能撮像の障害となる。
ホールマウント胚珠における染色体組織の細胞学的分析のための古典的な方法は、フォイルゲン染色の11から13を使用しています。これは、タンパク質の変性をもたらすので、クロマチン構造の破壊を引き起こすDNAの（次亜塩素酸を用いて）酸加水分解を含む。代わりに、女性の減数母細胞と配偶体細胞における染色体組織が （例えば14〜18を参照）は、半薄切片または解剖し、胚嚢とMMCにDAPI染色および免疫染色を用いて観察することができます。明らかに、しかし、手動の解剖と分割は、労働集約的であることができ、クロマチンエピトープの多数の定性的および定量的分析に妨げる。
ここでは、全体のマウントの下流細胞学的染色に適した種々のシロイヌナズナ胚珠を多数準備するために効率的なプロトコルを提供する。簡単に説明すると、花芽が固定液中でインキュベートされる、胚珠の行は心皮から解剖され、花粉減数母細胞19,20のために行ったように、スライドにアクリルアミドに包埋した。埋め込まれた胚珠は、さらに細胞壁消化および透過化の前に、メタノール、エタノール、キシレン中でクリアされ、固定されている。これらのステップの可能なバリエーションが議論されている。次いで、試料をDNA染色、免疫染色およびFISHのために使用することができる。準備モードは、効率的で、並列実験設備（最大16のスライドが異なる下流の解析のために一日に製造することができる）が可能になります。記載され治療は、ホールマウントで均質なイネーブル信号を、よく組織学的、細胞の保存生殖細胞および細胞型の間の定性的および定量的な比較に利益をもたらす、周囲の珠心細胞および核の組織。校正され、3次元再構成に続いて、CLSMベースの高分解能イメージング、蛍光シグナルの意味のある定量的な測定を可能にします。我々が正常に差別MMC 21にクロマチン動態を解析するために、この手順を使用し、雌性配偶体22を開発。ここではホールマウント胚珠内のヘテロクロマチン解析、クロマチン免疫染色、GFP免疫染色およびFISHの代表的な結果を提示する。今後も我々のプロトコルは、他の植物組織および種に適していると考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
顕花植物では、女性の生殖細胞系列は、このように技術的に困難なホールマウントで細胞学的染色をレンダリング、珠心や胚珠外皮を含むいくつかの細胞層に囲まれています。ここでは、このような全体マウントでのin situハイブリダイゼーション 、免疫染色、DNA染色および蛍光として細胞学的染色に適し胚珠多数の製造および加工を可能に効率的なプロトコルを提示する。我?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ueli Grossniklaus (University of Zürich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Zürich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1× PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1× PBS (prepare 10ml, store at 4°C) | ||
| 200mL 5% acrylamide mix in PBS | 34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1× PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. . An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al. Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Génétique. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Génétique. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. . Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
