En effektiv metode for kvantitativ, Single-celle Analyse av Kromatin Modifikasjon og Nuclear Arkitektur i hel-mount ovules i<em> Arabidopsis</em

Summary

Vi gir her en effektiv og pålitelig protokoll for farging, fluorescens in situ hybridisering, DNA farging fulgt av kvantitativ, bildebehandling med høy oppløsning i hel-mount Arabidopsis thaliana ovules. Denne metoden ble brukt for å analysere kromatin modifikasjoner og atom arkitektur.

Abstract

I blomsterplanter, er det somatiske-til-reproduktiv celle skjebne overgang preget av spesifikasjonen av spore mor celler (SMCS) i floral organer i voksen plante. Den kvinnelige SMC (megaspore mor celle, MMC) skiller i ovule primordium og gjennomgår meiose. Den valgte haploid megaspore deretter gjennomgår mitose å danne flercellet kvinnelige gametofytt, noe som vil gi opphav til kjønnscellene, eggcellen og sentral celle, sammen med tilbehør celler. Den begrensede tilgjengeligheten av MMC, meiocyte og kvinnelige gametofytt inne ovule er teknisk utfordrende for cytologisk og cytogenetiske analyser på celle-nivå. Spesielt er direkte eller indirekte immuno-deteksjons av cellulære eller atom epitoper svekket av dårlig penetrering av reagensene inne i plantecellen, og enkeltcelle-avbildning er demised av mangelen på optisk klarhet i hel-typen vev.

Således, har vi utviklet en effektiv metode for å analysere Nucløret organisasjon og kromatin modifisering i høy oppløsning på én celle i hel-mount innebygde Arabidopsis ovules. Den er basert på disseksjon og innstøping av faste ovuler i et tynt lag av akrylamid gel på et mikroskopisk lysbilde. De innebygde ovules er utsatt for kjemiske og enzymatiske behandlinger som tar sikte på å bedre vev klarhet og permeabilitet til farging reagenser. Disse behandlingene bevare cellulære og kromatin organisasjon, DNA og protein epitoper. Prøvene kan brukes for forskjellige nedstrøms cytologiske analyser, inkludert kromatin farging, fluorescens in situ hybridisering (FISH), og DNA-farging for heterochromatin analyse. Konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) bildebehandling, med høy oppløsning, etterfulgt av 3D rekonstruksjon åpner for kvantitative målinger ved encellede oppløsning.

Introduction

I blomstrende planter, begynner etablering av reproduktive linjene med differensiering av SMCS, kvinnelig MMC og mannlige microspore mor celle. MMC utvikler seg fra en sub-epidermal nucellar celle ved den distale enden av ovule primordium, og microspore mor celle utvikler seg fra sporogenous vev i anther locule, som ligger dypt inne i blomster organer ^en. SMCS gjennomgå meiose for å produsere haploide sporer, som deretter gir opphav til de gametophytes ved mitose. Den kvinnelige gametofytt, eller embryo sac, består av ett egg celle, en sentral celle, to synergids og tre antipodals. Den mannlige gametofytt eller pollen, er sammensatt av en vegetativ celle og to sædceller. Mens den mannlige gametofytt fortsatt en relativt tilgjengelig objekt-of-studien, er den kvinnelige gametofytt innebygd i ovule, selv vedlagt i blomster carpel, og dermed stiller konkrete utfordringer til molekylære og cytologiske analyser. Nylig har imidlertid laserassistertmicrodissection tilbudt en elegant løsning slik transcriptomic analyser i MMC og kvinnelige gametophytic celler ^2-4. I tillegg til kandidat genekspresjon analyser, for eksempel ved bruk RNA in situ hybridisering eller reporter gen analyser, cytologiske analyser lar undersøke dynamikken i endogene cellulære komponenter ved hjelp av spesifikke direkte cellefarging eller indirekte farging. Spesielt, cytogenetisk flekker ved hjelp av FISH og DNA farging, sammen med farging av kromatin endringer eller kromatin komponenter er sentrale innfallsvinkler for å belyse kromatin dynamikk og atom organisasjon i Arabidopsis ^fem. Vanligvis medfører meiose spesifikke kromosom dynamikk som har blitt godt undersøkt i anlegget mannlig meiocytes ^6,7; videre i stor skala, celle-spesifikke kromatin omorganisering, som sannsynligvis gjenspeiler dynamisk epigenetisk reprogrammering har blitt beskrevet under pollen utvikling ^8-10. I motsetning til dette, på grunnav den relative utilgjengelighet av den kvinnelige meiocyte og gametofytt, disse undersøkelsene forblir teknisk vanskelig å påføre, og krever ofte snitte eller manuell disseksjon og enzymatisk fordøyelse (se nedenfor). I tillegg er det utbredt mangel på optisk klarhet i hel-mount et hinder for høyoppløselig avbildning av kjønnsceller i intakte ovules.

En klassisk metode for cytologisk analyse av kromosom organisasjon i hel-mount ovules bruker Feulgen er flekker ^11-13. Det omfatter syrehydrolyse (ved bruk av hypoklorsyre) av DNA som resulterer i protein denaturering og dermed fører til ødeleggelse av kromatin struktur. Alternativt kan observeres kromosom organisasjon i kvinnelige meiocytes og gametophytic celler ved hjelp DAPI farging og farging på semi-tynne snitt eller dissekert embryo sekker og MMC (for eksempel se ^14-18). Det er imidlertid klart, manuell disseksjon og seksjonering kan være arbeidskrevende oghindrer på kvalitativ og kvantitativ analyse av et stort antall kromatin epitoper.

Her gir vi en effektiv protokoll for å forberede et stort antall Arabidopsis ovules egnet for en rekke nedstrøms cytologisk flekker i hel-mount. I korte trekk, er blomsterknopper inkuberes i en fiksativ løsning, er rader med ovules dissekert fra carpel og innebygd i akrylamid på lysbildet som gjøres for pollen meiocytes ^19,20. De innebygde ovuler er ytterligere fjernet og fiksert i metanol, etanol, og xylen før cellevegg fordøyelse og permeabilization. Mulige variasjoner av denne fremgangsmåten er omtalt. Prøvene kan deretter bli brukt for DNA beising, farging, og fisk. Preparatet modus er effektiv og gjør det mulig ved parallell eksperimentelle oppsett (opp til 16 slides, kan fremstilles på en dag etter ulike nedstrøms-analyse). Behandlingene er beskrevet aktiver homogene signaler i hel-mount og godt bevart histologisk, mobilnettet,og kjernefysiske organisasjon i kjønnsceller og omkringliggende nucellar celler som gagner kvalitative og kvantitative sammenligninger mellom celletyper. Kalibrert, CLSM-baserte høy oppløsning avbildning etterfulgt av 3-dimensjonale rekonstruksjon muliggjør meningsfylte kvantitative målinger av fluorescerende signaler. Vi hell brukt denne prosedyren for å analysere kromatin dynamikk i differensierende MMC ²¹ og utvikle kvinnelige gametofytt ^22; vi presenterer her representative resultatene av heterochromatin analyse, kromatin farging, GFP farging og FISH i hel-mount ovules. Vi tror videre at vår protokoll vil være egnet for andre plantevev og arter.

Protocol

Fremgangsmåten er beskrevet i arbeidsflyten i figur 1, og oppsett for disseksjon og innstøping av vev er presentert i figur 2.. En. Tissue Fixation Samle 20-30 carpels i en mikro rør som inneholder rykende BVO fiksativ buffer på is. Fest vev 30 min med forsiktig risting ved romtemperatur. Spinn rør som inneholder de carpels i fiksativ i en bordmikrosentrifuge 1 min ved 400 x g. Fjern forsiktig den fiksativ buffer…

Representative Results

Vi tilbyr en robust protokoll for storskala utarbeidelse og behandling av Arabidopsis ovules egnet for cytologisk farging i hel-mount. Takket være innebygging, de ovules beholde en 3-dimensjonal struktur (figur 3). Videre vevet foredling herunder optisk avklaring lar bildebehandling subcellulære strukturer i høy oppløsning. Figur 4 viser DNA flekker i hel-mount ovule primordia hvor heterochromatin fremstår som lyse, godt definert iøynefallende fokus (ingen deconvolution b…

Discussion

I blomsterplanter, er den kvinnelige reproduktive avstamning omgitt av flere cellelag inkludert nucellus og ovule teguments, dermed rende cytologisk flekker i hel-mount teknisk utfordrende. Her presenteres en effektiv protokoll som muliggjør fremstilling og bearbeiding av et stort antall ovuler egnet for cytologisk farging som farging, DNA farging og fluorescens in situ hybridisering i hel-festet. Vi hell brukt det for analyse av den kvinnelige reproduktive germline i Arabidopsis ^21,22. Den…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1× PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1× PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1× PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1× PBS (prepare 10ml, store at 4°C)
200mL  5% acrylamide mix in PBS			34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1× PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C)
20% sodium sulfite			0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek