Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em> Arabidopsis</em
Summary
Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.
Abstract
Çiçekli bitkilerde, somatik-to-üreme hücresi kader geçiş yetişkin bitkinin çiçek organlarında spor anne hücrelerin şartnamede (SMC'ler) ile işaretlenir. Kadın SMC (Megaspor anne hücre, MMC) yumurta hücresi primordiumunun içinde ayırır ve mayoz uğrar. Seçilen haploid Megaspor sonra birlikte aksesuar hücreleri ile, gamet sebebiyet verecek çok hücreli dişi gametofit, yumurta hücresi ve merkez hücre oluşturmak için mitoz uğrar. Ovüldeki içindeki MMC, meiocyte ve dişi gametopitin sınırlı erişilebilirlik sitolojik için teknik olarak zor ve sitogenetik tek hücre düzeyinde analiz eder. Özel olarak, hücresel ya da nükleer epitoplar doğrudan ya da dolaylı immunodeteksiyon bitki hücresi ve tek hücre görüntüleme içindeki reaktiflerin zayıf penetrasyon ile bozulur tüm montaj dokularda optik berraklık eksikliğinden demize edilir.
Böylece, Nucl analiz etmek için etkili bir yöntem geliştirditüm montaj gömülü Arabidopsis ovüllerindeki tek bir hücrede yüksek çözünürlükte kulak organizasyon ve kromatin modifikasyonu. Bu, bir mikroskop lamı üzerine akrilamid jel ince bir tabaka olarak diseksiyon ve sabit ovüllerin gömülmesi dayanmaktadır. Gömülü ovüller immüno-boyama reaktiflere doku açıklık ve geçirgenlik iyileştirmeyi amaçlayan kimyasal ve enzimatik tedavilere tabi tutulur. Bu tedaviler hücresel ve kromatin organizasyonu, DNA ve protein epitoplar korumak. Numuneler Kromatin immüno-lekeleme, in situ hibridizasyon (FISH) floresan ve heterokromatin analiz için DNA lekeleme gibi farklı alt sitolojik analizi için kullanılabilir. 3D rekonstrüksiyon geçmez yüksek çözünürlüklü konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) görüntüleme, tek hücreli çözünürlükte nicel ölçümler sağlar.
Introduction
Çiçekli bitkilerde üreme soy kurulması SMC'lerinin farklılaşması, kadın MMC ve erkek Mikrospor anne hücre ile başlar. MMC ovül primordiumunun uzak ucunda bir alt epidermal nucellar hücreden gelişen ve mikrospor anne hücre derin çiçek organları 1 içinde bulunan anter lokül içinde sporogenous dokusundan gelişir. SMC'ler sonra mitoz üzerine gametofitleri doğuran haploid sporlar, üretmek için mayoz tabi. Dişi gametofit veya embriyo kesesi, bir yumurta hücresinin, tek bir merkezi hücrenin, iki synergids ve üç zıtlar oluşur. Erkek gametofit veya polen, bir bitkisel hücre ve iki sperm hücrelerinin oluşmaktadır. Erkek gametofit nispeten erişilebilir nesne-of-çalışma devam ederken, kadın gametofitin kendisi çiçek karpelin içine, ovüldeki içine gömülü, ve dolayısıyla moleküler ve sitolojik analizler belirli zorluklar teşkil edilir. Ancak son zamanlarda, lazer desteklimikrodisseksiyon Transkriptomik MMC ve kadın gemotofitik hücrelerde 2-4 analizleri sağlayan zarif bir çözüm sundu. Aday gen ekspresyonuna ek olarak sitolojik analizleri, belirli hücre boyama doğrudan ya da dolaylı immüno-lekeleme kullanılarak, endojen hücre bileşenlerinin dinamiklerini araştıran, in situ melezleme ya da raportör gen deneyleri, örneğin RNA sağlar kullanarak analiz eder. Özellikle, birlikte kromatin modifikasyon veya kromatin bileşenleri immün ile, FISH ve DNA boyama kullanılarak sitogenetik boyama Arabidopsis'de 5 kromatin dinamikleri ve nükleer organizasyon aydınlatmak için merkezi yaklaşımlardır. Tipik olarak, mayoz de 6,7 meiocytes bitki erkekte araştırılmıştır spesifik kromozom dinamikleri gerektirir; muhtemelen dinamik epigenetik yeniden programlama yansıtan daha büyük ölçekli, hücreye özel kromatin düzenlenmesi, polen gelişimi sırasında 8-10 tarif edilmiştir. Buna karşın, nedenikadın meiocyte ve gametofit göreli erişilememesi nedeniyle, bu soruşturmaların uygulamak teknik olarak zor kalır ve sık sık (aşağıya bakınız) kesit veya manuel diseksiyonu ve enzimatik sindirim gerektirir. Buna ek olarak, tüm montaj içinde optik netlik yaygın olmaması sağlam ovüllerindeki üreme hücrelerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir engeldir.
Tüm montaj ovüllerindeki kromozom örgüt sitolojik analizi için klasik bir yöntem Feulgen en lekelenme 11-13 kullanır. Protein denatürasyonu ile sonuçlanır ve bu nedenle, kromatin yapısının yok edilmesine neden olan DNA (hipokloröz asit kullanılarak) asit hidrolizi içerir. Alternatif olarak, kadın meiocytes ve gemotofitik hücrelerde kromozom organizasyonu (örneğin 14-18 bakınız) yarı-ince kesitler veya disseke embriyo keseleri ve MMC Dapi ve immun boyama kullanılarak görülebilir. Açıkçası, ancak, manuel diseksiyon ve kesit yoğun emek olabilir vekromatin epitoplarının büyük bir sayıda nitel ve nicel analizi engellemektedir.
Burada bütün montaj içinde alt sitolojik lekelenme çeşitli için uygun Arabidopsis ovüller, çok sayıda hazırlanması için etkin bir protokol sağlar. Kısaca, çiçek tomurcukları bir sabitleyici çözelti içinde inkübe edilir, ovüller sıraları karpelin ayrılır ve polen meiocytes 19,20 için yapıldığı gibi slayt üzerinde akrilamid gömülü. Gömülü ovüller bundan başka, metanol, etanol, ve hücre duvarı sindirim ve nüfuziyet önce iksilen içinde temizlendi ve sabitlenir. Bu adımların olası varyasyonları tartışılmıştır. Numuneler daha sonra DNA lekeleme, imüno ve FISH için kullanılabilir. Hazırlık modu verimli ve (en fazla 16 slaytlar farklı alt analizi için bir gün içinde hazırlanabilir) paralel deneysel set-up sağlar. Açıklanan tedaviler, tüm montaj içinde homojen sinyalleri etkinleştirmek ve iyi histolojik, hücresel konservelerive hücre tipleri arasında nitel ve nicel karşılaştırmaları yarar üreme hücreleri ve çevresindeki nucellar hücrelerde nükleer organizasyonu. Kalibre, 3-boyutlu rekonstrüksiyon ardından CLSM-tabanlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme floresan sinyalleri anlamlı kantitatif ölçümleri sağlar. Biz başarıyla ayırt MMC 21 ve dişi gametofit 22 gelişmekte kromatin dinamiklerini analiz etmek için bu prosedürü kullanılır; biz burada tüm montaj ovüllerindeki heterokromatinin analizi, kromatin immünoboyamayla, GFP İmmunosteyn ve FISH temsilcisi sonuçlarını sunmak. Bu protokol daha da diğer bitki dokularında ve türleri için uygun olacağına inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çiçekli bitkilerde, dişi üreme soy nedenle teknik zorlu tüm montaj sitolojik lekelenme render nucellus ve ovül teguments dahil olmak üzere birçok hücre tabakası ile çevrilidir. Burada örneğin tam montaj in situ hibridizasyon immüno-boyama, DNA boyama ve floresan gibi sitolojik boyanması için uygun ovüller, çok sayıda hazırlanmasını ve işlenmesini sağlayan etkin bir protokol sunmaktır. Başarıyla Arabidopsis 21,22 dişi üreme tohum çizgisi analizi için kullanılı…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ueli Grossniklaus (University of Zürich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Zürich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1× PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1× PBS (prepare 10ml, store at 4°C) | ||
| 200mL 5% acrylamide mix in PBS | 34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1× PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. . An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al. Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Génétique. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Génétique. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. . Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
