Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Résumé

Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.

Résumé

Embryons de poisson zèbre constituent un outil puissant pour le dépistage à grande échelle de petites molécules. Poisson-zèbre transgénique qui exprime des protéines rapporteurs fluorescents sont fréquemment utilisés pour identifier des produits chimiques qui modulent l'expression des gènes. écrans chimiques qui essai de fluorescence chez le poisson zèbre en direct s'appuient souvent sur des équipements coûteux, spécialisé pour le criblage à haut contenu. Nous décrivons une procédure à l'aide d'un microscope à épifluorescence standard avec une platine motorisée à automatiquement l'image des embryons de poisson zèbre et de détecter la fluorescence spécifique de tissu. Utilisation de poisson-zèbre transgénique pour signaler que l'activité du récepteur des oestrogènes via l'expression de la GFP, nous avons développé une procédure semi-automatique pour cribler des ligands du récepteur de l'œstrogène qui activent le rapporteur d'une manière tissu-spécifique. Dans cette vidéo, nous décrivons les procédures pour rangeant embryons de poisson zèbre à 24-48 heures après la fécondation (HPF) dans une plaque de 96 puits et ajouter de petites molécules qui se lient les récepteurs des œstrogènes. À 72-96 HPF, des images de chaque puits dela totalité de la plaque sont collectées automatiquement et manuellement pour inspecter fluorescence spécifique d'un tissu. Ce protocole démontre la capacité de détecter les oestrogènes qui activent les récepteurs dans les valves cardiaques, mais pas dans le foie.

Introduction

Poisson-zèbre transgénique ont été développés qui permettent la visualisation directe de l'activité dans les voies, telles que les facteurs de croissance des fibroblastes ^1, l'acide rétinoïque et les œstrogènes ^{2 3,} dans embryons vivants signalisation. De tels outils permettent le dépistage de substances qui perturbent les voies de signalisation (dosée comme changement de l'intensité de fluorescence) ou à des composés chimiques qui modulent la signalisation d'une manière spécifique d'un tissu (changement de fluorescence localisation) ^4. Capture d'image automatisé augmente le débit d'écrans chimiques considé....

Protocole

NOTE: Ce protocole a été approuvé par l'Université de l'Alabama à comité de protection et d'utilisation des animaux Birmingham.

1. Élevage de poisson zèbre et collections d'œufs

1. Trois jours avant le début de l'exposition aux produits chimiques, assembler bassins d'élevage avec séparateurs à mâles et femelles séparés. Remplir chaque mi-chemin du réservoir avec de l'eau du système de l'aquaculture. L'utilisation d'un filet, transférer Tg (5xERE: GFP) ^{poissons c262/c262} de bassins d'élevage, en plaçant 2 mâles et 3 femelles dans chaque réservoir séparé par un diviseur....

Résultats

La figure 1 montre des images composites à partir de puits individuels d'une plaque à 96 puits. Chaque image composite est composé de 59 images individuelles avec 5% d'image de chevauchement. Notez que le poisson zèbre en direct sont orientés de façon aléatoire au sein de chaque bien, mais nous sommes en mesure de distinguer la fluorescence dans le coeur du foie. Images en fond clair sont utiles comme références pour évaluer l'orientation du poisson zèbre et de visualiser les anomalies morph.......

Discussion

Ce protocole décrit une méthode simple pour automatiquement fluorescence spécifique des tissus image embryons de poisson zèbre. Le protocole a été développé en utilisant un Zeiss Axio Observer. Z1 avec Zen logiciel Blue 2011, cependant la technique peut être adaptée en utilisant n'importe quel microscope inversé avec une platine motorisée et un logiciel de contrôle de microscope qui peut effectuer carrelage pour créer des images composites. L'équipement d'un microscope inversé avec une platine motorisée peut.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipettes de transfert en plastique ; à alésage large	Fisher	13-711-23
Pipettes de transfert en plastique ; pointe fine	Fisher	13-711-26
Plaques à fond plat et rondes à 96 puits	Fisher	21-377-203
Plaques de 100 x 35 mm	Fisher	08-757-100D
Plaques de 35 x 60 mm	Fisher	08-757-100B
Pince fine Dumont #5	Fine Science Tools	11254-20	dimensions de la pointe 0,05 x 0,01 mm, pour l’élimination manuelle des chorions des embryons
Méthanesulfonate de tricaïne	Sigma Aldrich	A5040-25G	voir le livre Zebrafish pour la recette (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)  ;
1-phényl-2-thiourée (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Préparer un stock de 20 mM (100x) et l’utiliser à 200 &mu ; M dans E3B  ;
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Le protocole nécessite un microscope à fluorescence inversée avec une platine motorisée
Objectif à longue distance de travail 20x	Carl Zeiss		Nous utilisons un objectif avec une distance de travail de 0,4 NA et 8,4 mm
Appareil photo numérique Axiocam HRm	Logiciel de contrôle de microscope Carl Zeiss
			ZenBlue 2011Le protocole nécessite un logiciel d’automatisation et de contrôle de la microscopie pour permettre la capture d’images en mosaïque à l’aide d’une platine motorisée
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1 ; 25 grammes	de solution à 2 % dans de l’eau osmosée pour une utilisation dans E3B (ci-dessous)
E3B			60X E3 SOLUTION : NaCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; - 17,2 grammes KCl  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; - 0,76 gramme CaCl2-2H2O  ;   ;   ;   ; - 2,9 grammes MgSO4-7H2O  ; - 4,9 grammes ou MgSO4 - 2,39 grammes Dissoudre dans 1 litre d’eau Milli-Q ; CONSERVER DANS UNE BOUTEILLE STÉRILE DE 1 LITRE. 1X E3B SOLUTION POUR POISSON ZÈBRE : 60X E3  ;   ;   ;   ;   ; 150 ml 2 % de bleu de méthylène  ;   ;   ;   ; 100 &mu ; l  ; Porter à 9 litres avec de l’eau Milli-Q   ;