טיהור צעד אחד של חלבונים מתויגים-Twin-סטרפטוקוקוס והמתחמים שלהם בSuberate (BS3) שרף סטרפטוקוקוס-Tactin הצולב עם Bis (sulfosuccinimidyl)
Summary
שיטה מתוארת לניקוי יעיל של חלבוני תאום סטרפטוקוקוס מתויג היתוך והמתחמים הספציפיים שלהם על streptavidin הותאם שרף (סטרפטוקוקוס-Tactin) קוולנטית צולבים עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3). יש שיטת היתרונות של מהירות מהירה, התאוששות חלבון מטרה טובה וטוהר גבוהים, והוא תואם את ניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.
Abstract
טיהור זיקה של חלבוני היתוך סטרפטוקוקוס מתויגים על שרפים נושאים streptavidin מהונדס (סטרפטוקוקוס-Tactin) הפכה לשיטה נפוצה לבידוד של קומפלקסי חלבונים בתנאים פיסיולוגיים. יש חלבוני היתוך המכילים שני עותקים של סטרפטוקוקוס התג השני, מיועדים תאום סטרפטוקוקוס תג או SIII תג, היתרון של זיקה גבוהה יותר לסטרפטוקוקוס-Tactin בהשוואה לאלו המכילים סטרפטוקוקוס תג אחד בלבד, ובכך מאפשרים טיהור חלבון יעילה יותר. עם זאת, יתרון זה קוזז על ידי העובדה שelution של חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס עם ביוטין עשוי להיות חלקי, מה שמוביל להחלמה חלבון נמוכה. ההתאוששות ניתן לשפר באופן דרמטי באמצעות elution denaturing עם נתרן גופרתי dodecyl (SDS), אבל זה מוביל ללדגום זיהום עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר מהשרף, מה שהופך את assay עולה בקנה אחד עם ניתוח proteomic במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו שיטה לפיה tetramer מצמידים שרף של סטרפטוקוקוס-Tactinהוא התייצב לראשונה על ידי קוולנטיים cross-linking עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3) והשרף צולבים וכתוצאה מכך לאחר מכן נעשה שימוש כדי לטהר מתחמי חלבון מטרה בשלב טיהור אצווה אחת. elution יעיל עם SDS מבטיח התאוששות חלבון טובה, ואילו היעדר זיהום סטרפטוקוקוס-Tactin מאפשר ניתוח חלבון במורד הזרם על ידי ספקטרומטריית מסה. כהוכחה של מושג, שאנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור של חלבון נגיפי SIII מתויג VPG-Pro מגרעינים של נ 'נגוע בנגיף צמחי benthamiana באמצעות שרף polymethacrylate סטרפטוקוקוס-Tactin צולבים עם BS3. אותו הפרוטוקול יכול לשמש כדי לטהר את כל חלבון מתויג התאום סטרפטוקוקוס של עניין ולאפיין השותפים המחייבים הפיסיולוגיים שלו.
Introduction
בשנים האחרונות, טכנולוגית סטרפטוקוקוס התג הפכה בשימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר ביו, כוללים פרוטאומיקה וביולוגיה מבנית. טכנולוגיה זו חלבון הטיהור, אשר מסתמכת על השילוב של חלבונים רקומביננטי לפפטיד סטרפטוקוקוס תג קצר, התבגרה עם כניסתו של מטריצות זיקה נשאו סטרפטוקוקוס-Tactin, גרסה מהונדסת גנטי של streptavidin עם קיבולת מחייב-peptide משופרת. 1, 2 חלבוני היתוך המכילים שני עותקים של סטרפטוקוקוס התג השני, מיועד תאום סטרפטוקוקוס תג או SIII תג, תערוכת זיקה גבוהה יותר עבור מטריצות סטרפטוקוקוס-Tactin מאלה המכילים סטרפטוקוקוס תג אחד בלבד, מה שמבטיח טיהור יעילה יותר של החלבונים רקומביננטיים ו שותפיהם הקשורים המחייבים. עם זאת, הזיקה גבוהה יותר של חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס לסטרפטוקוקוס-Tactin יש גם החסרון שלה. elution התחרותי של כגון חלבונים עם ביוטין העודף עשוי להיות חלקי, מה שמוביל לירידה בתשואה של חלבון מטרה. מ 'חלופת עפרות יעילה היא elution עם SDS, אבל זה מוביל לזיהום מדגם לא רצוי עם סטרפטוקוקוס-Tactin שוחרר מהשרף, מה שהופך את assay עולה בקנה אחד עם ניתוח proteomic. מאמר זה מציג טכניקה כדי להתגבר על מגבלה זו על ידי הייצוב הראשון tetramer מצמידים השרף של סטרפטוקוקוס-Tactin ידי cross-linking הכימי ולאחר מכן באמצעות SDS לelute חלבונים מתויגים תאום סטרפטוקוקוס ומתחמים הקשורים בם מהשרף צולבים וכתוצאה מכך. לפיכך, תשואת חלבון מספקת יכולה להיות מושגת ללא זיהום מדגם עם סטרפטוקוקוס-Tactin, ובכך לאפשר ניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה.
השיטה מתאימה לטיהור של כל חלבון היתוך רקומביננטי עם משטח חשוף SIII תג 3 או תאום סטרפטוקוקוס תג (WSHPQFEK רצף חומצות אמינו (GGGS) 3 WSHPQFEK וSAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, בהתאמה). החלבון יכול להיות מ, חיה או צמח מקור חיידקים ויכול להיות מבודד משני תאים בסך הכלlysate או שבריר אברון מועשר. כדוגמא, אנו מתארים כאן הטיהור של חלבון SIII מתויג VPG-Pro של וירוס תפוחי אדמה (PVA) 4 מהחלק הגרעיני של צמחי benthamiana Nicotiana נגועים ב-PVA. שבריר הגרעיני היה מבודד כפי שתואר בעבר 5, בשינויים הבאים: תאים לא טופלו בפורמלין, בוטיראט נתרן הוחלף בכל המאגרים עם פלואוריד הנתרן 5 מ"מ, מעכבי פרוטאז שלמים הוחלף עם PMSF, בחילוץ טריטון X-100 ריכוז חיץ # 2 הונמך ל0.3% (v / v) והגלולה הגרעינית שהושגה על ידי צנטריפוגה באמצעות כרית סוכרוז (# חיץ חילוץ 3) הייתה מושעה ב1.45 מיליליטר של חיץ מחייב טרום צונן ומסובב ל1.5 שעות ב 4 ° C. התמצית הגרעינית וכתוצאה מכך המכילה חלבון הפיתיון מתויג-SIII ומתחמים קשורים (מדגם חלבון פיתיון) הייתה מעובד על פי הפרוטוקול המפורט להלן (ראה סעיף 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול לעיל יכול לשמש כדי לטהר את כל חלבון פיתיון מתויג התאום סטרפטוקוקוס של עניין והמכלולים הקשורים אליו בכל חיץ מתאים שאינו מכיל ביוטין או denaturants החזק. בגרסה הנוכחית של הפרוטוקול, כריכה ושטיפה מבוצעת בתנאים מחמירים יחסית בנוכחות מלח גבוה וחומרי ניקוי שאינו יונ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו בתודה להכיר תמיכה הטכנית של סיני Miettinen, מינה Pöllänen וטארו Rautavesi. אנו מודים הלקינו Nurkkala למתן HEK 293 תאים להביע GFP-tagged תאום סטרפטוקוקוס וPekka evijarvi לאספקת ציוד הקלטת קול. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה של פינלנד, להעניק מספרים 138,329, 134,684 ו258,978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).
