高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

Summary

非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。

Abstract

Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introduction

アルツハイマー病（AD）は、タウオパチーとして知られる神経変性疾患の大規模なコレクションの一つである。典型的な病理学の基礎となるタウオパチーは、ニューロン、アストロサイトとミクログリア^1-4で神経原線維変化、NFTの、です。 NFT密度は、認知機能障害^3,5及びニューロン損失⁶と相関する。 NFTはまっすぐまたは対らせんフィラメント^{（PHF）7,8を}形成（以下、「P-タウ」とも呼ばれる）は、主に過剰リン酸化タウタンパク質が含まれています。タウは、ニューロンのシグナル伝達および輸送^9,10に必須である軸索輸送を促進すると考えられ、微小管関連タンパク質である。各タウ分子は、正常な脳で2〜3リン酸を含むが、タウオパチー患者¹¹内の複数の折り目によってホスホリル含有量が増加する。複数のキナーゼは、GSK3β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β）及びCDK5（サイクリン·ドなどのタウの過剰リン酸化に貢献する可能性があるペンダントキナーゼ^5）12,13が、病理学的リン酸化のための直接の引き金は、とらえどころのない¹⁴のまま。微小管結合モチーフまたは周辺の異常なリン酸化は、微小管¹⁵からタウを解離し、p-タウは、最終的にNFT介在物に重合させることができる直鎖または対らせんフィラメントにオリゴマー化する細胞体コンパートメントにタウ誤局在を引き起こす。タウの過剰リン酸化、NFT形成、及び神経変性の間の緊密な提携は、p-タウのもつれがアポトーシスおよび他の細胞毒性反応を誘発するため、タウオパチーの神経変性^16,17のための根本的な原因であることが流行しているという仮説につながった。この前提に基づく薬物スクリーニングと初期の臨床試験は^、18を立ち上げてきた。しかし、この仮説は^19,20挑戦に直面している。例えば、サンタクルスらは、トランスジェニックマウスの認知機能は、変異体の発現を抑制することにより改善することができることを示したのNFTは、既存のタウ分子²¹から形成するために続けていても、人間のタウ、。 ショウジョウバエモデルでは、NFTは、基礎となる神経細胞^22,23を保護するために有毒な細胞質ゾルタウを隔離することが示された。明らかに、NFTの病因の役割は、もしあれば、大いにタウオパチー治療薬の開発の方向性に影響を与えます。

いくつかのβシート好ましい蛍光色素、電子顕微鏡法、光散乱分光法^24-27の結合によって示されるように、高濃度では、組換えまたは正常な脳のタウタンパク質は自然に、ゆっくり、 インビトロでの PHF様構造へと重合する。追加ヘパリンまたはアラキドン酸、人間の脳に豊富脂肪酸は、大幅にタウisoform-と誘導物質の濃度依存マナー^28-32でPHFの形成を促進する。興味深いことに、過リン酸化タウは、AD脳から精製またはインビトロリン酸化反応A に網羅して調製より速くggregatesと、より効率的に^26,33-35。これらの結果は、p-タウの病理学的役割とよく一致している。 p-タウの凝集に基づくインビトロシステムは、このようにADの薬物スクリーニングのための強力なツールとして機能することができる。

タウ凝集およびADの進行神経変性、ならびにAβ斑をターゲットに医薬品開発の最近の失敗、AD ^36-38のもう一つの重要な組織学的マーカーの間に密接な関連性を考えると、タウ凝集を制御する薬を発見するの関心が高まっている。実際、いくつかのグループがすでに一次アッセイとして体外タウ凝集反応に使用して、異なるスループットで薬物スクリーニングを開始しました。多くの化学物質は、 インビトロ ^39-42 でタウ凝集阻害または逆転活性を示すことが見出された。しかし、現在のすべてのタウ凝集レギュレータスクリーンは蛍光体の主要な病理学的なマークをミス修正されていないタウを使用ylation、ADの治療におけるこれらの化合物を使用しての特異性および有効性の懸念を高める。

生化学的特性およびADの薬物スクリーニングのための凝集アッセイの開発の大きな障害の一つは、病態生理学的に関連した高リン酸化タウタンパク質の十分な量の産生である。タウの1N4RアイソフォームとGSK-3βキナーゼはEに共発現されているジッパーアシスト触媒反応システムを用いて、 大腸菌は、ロイシンジッパー融合タンパク質として、私たちは、この課題を克服している（。隋ら 、提出され、タウとp-タウの最終製品については、図1を参照してください。また、p-タウの予備質量分析の特性評価のための^43を参照）。タウの異なるリン酸化部位に特異的な9抗体のパネルから、陽性シグナルは、8つの位置で見られた（データは示さず）。以下では、集約運動Dを区別できるプロトコルおよびインストルメンテーションを記述する変更されていないタウとpタウ種間ifferences。これらのアッセイは^、26アミロイド^結合の際に、チオフラビンT（THT）またはチオフラビンS（THS）の蛍光の増加（タウ凝集体）を測定した公開されたプロトコルから変更された。最初の「端末」は、無色素のアプローチは、凝集反応が組み立てられ、アミロイド色素の非存在下でインキュベートした。異なる時点で、各反応のアリコートを除去し、タウ凝集体を結合するためのThTの凝集を停止し、可能にするためのThT含有緩衝液の等量。蛍光は、IAP FluoroMax-2蛍光光度計で測定される。第二」の色素「継続的なモニタリングアッセイでは、ThTのまたはTHSは凝集反応に含まれる。蛍光は、手動で、実験全体を通じて連続的に測定またはマルチプレートリーダーを使用することができる。加えて、我々は継続的な測定MOにおける集計のためのタウおよびp-タウの近生理的濃度を使用するアッセイを説明デ。リン酸化の効果は容易に検出可能のままである。以下では、ステップバイステップの操作手順を説明し、これらのアッセイの代表的な結果が表示されます。各アプローチの長所と短所のいくつかの議論だけでなく、潜在的な薬剤スクリーニングアプリケーションが続きます。

高濃度では、タウは自然にアミロイド様構造へと集約されます。しかし、実験室で、タウ線維化は、典型的には、ヘパリン（平均分子量6,000グラム/モル）及びアラキドン酸のような誘導因子によって促進される。ここに示した例には、30μMのヘパリンが含まれています。タウアミロイド凝集体の形成を、チオフラビンT（ThTの）またはチオフラビンS（THS）のアミロイド結合性から生じる蛍光によりモニターされる。 （;：485 nmの発光ピークを450nm励起）タウ凝集体に結合すると、ThTの蛍光の赤いシフトを示す。 THSは、一方では、アミロイドは結合の前に510ナノメートル（450nmで励起）で弱い発光を有するが、このfluorescenc電子は、このような凝集したタウ^44とアミロイドタンパク質の存在下で有意に増加する。両方の色素は、タウおよびp-タウ凝集を検出するのに適しています。ためのThTの強力かつ比較的広い発光ピーク（ 図2参照）から、510 nmでの蛍光単位でわずか30％の減少がある。いずれかの染料を使用する際の便宜のために、我々は、タウ凝集をモニターするために、励起/発光波長（ すなわち 、450nmの/ 510 nm）の同じ組み合わせを使用する。

タウ凝集は、アッセイの目的とタウタンパク質の可用性に応じて、染料の存在下または非存在下で行うことができる。反応の両方のモードを以下に示します。単一のサンプル蛍光光度計（ISA-SPEX FluoroMax-2）と、マルチプレートリーダー（スペクトラマックスM2） – 加えて、我々は2つ​​の異なる機器の動作を実証する。読者は彼らの特定のニーズや機器の可用性に合わせて、これらのプロトコルを適応させることができるはずです。

Protocol

試薬の調製集計バッファを準備し（20mMトリス、pH7.4中、100mMのNaCl、1mMのEDTA）。ヶ月間、室温で安定して保管してください。サプリメント1mMのは、使用前に（DTT）をジチオスレイトール。 NOTE：HEPESベースの緩衝液（10mM HEPES、pH7.5で、0.1mMのEDTA、5mMのDTT）もまた、タウ凝集に類似の結果を生成する。 0.22μmの無菌フィルターユニットによりチオフラビンTまたはチオフラビンS?…

Representative Results

組換えtauおよびp-タウ（ 図1）を使用して、我々は、タウを含む、タンパク質凝集体をアミロイドへの結合の際のThTとTHSの強い蛍光発光を利用して、タウの凝集およびp-タウの動態を比較するために2つの異なるプロトコルを設立及びp-タウ（ 図2）。凝集反応における蛍光色素の有無にかかわらず、我々は過剰リン酸化（ 図3-5）でタウ凝集の一貫した強化?…

Discussion

このプロトコルは、リン酸化依存速いタウ凝集速度論を検出する別のアッセイ条件と楽器を示しています。端末アッセイでは、蛍光色素ThTを、各時点でのマスターミックスから除去された反応の一部に加えられる。アミロイド結合誘起蛍光次に^26で測定される。第有する染料モードでは、タウ凝集は、タウ凝集体の成長のリアルタイム自動評価に適したこの種の反応をレンダリングの…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4°C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80°