Cellulaire in vitro modèle de culture pour le contrôle des produits chimiques toxiques inhalés

Summary

Ce protocole est conçu pour démontrer Procédé d'exposition de cultures cellulaires à des produits chimiques toxiques inhalés. Exposition des différenciée interface air-liquide (ALI) des cultures de cellules épithéliales des voies aériennes fournit un modèle unique de l'exposition des voies respiratoires à des gaz toxiques tels que le chlore. Dans ce manuscrit, nous décrivons effet de l'exposition au chlore sur les cultures à l'interface air-liquide de cellules épithéliales et de la culture submergée de cardiomyocytes. In vitro des systèmes d'exposition permettent études mécanistiques importantes pour évaluer les voies qui pourraient ensuite être utilisés pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.

Abstract

Les cultures cellulaires sont indispensables pour développer et d'étudier l'efficacité d'agents thérapeutiques, en vue de leur utilisation dans des modèles animaux. Nous avons la capacité unique de modéliser les cellules de l'épithélium respiratoire humain et le muscle cardiaque bien différenciées. Cela pourrait être un outil précieux pour étudier les effets délétères des produits chimiques toxiques inhalés, tels que le chlore, qui peuvent normalement interagir avec les surfaces cellulaires, et former divers sous-produits lors de la réaction avec de l'eau, et la limitation de leurs effets dans des cultures submergées. Notre modèle en utilisant des cultures de cellules épithéliales des voies aériennes humaines bien différenciés à l'interface air-liqiuid contourne cette limitation ainsi que fournit l'occasion d'évaluer les mécanismes critiques de la toxicité des produits chimiques toxiques inhalés potentiels. Nous décrivons perte accrue de l'intégrité de la membrane, la caspase libération et la mort sur chimique toxique par inhalation tels que l'exposition au chlore. Dans cet article, nous proposons des méthodes pour modéliser l'exposition au chlore dans le cœur des mammifères et des voies respiratoires épithéliales caunes de la culture et des tests simples pour évaluer son effet sur ces types cellulaires.

Introduction

L'exposition à des produits chimiques toxiques inhalés (CIT) / gaz comme le chlore (Cl ₂₎ demeure un problème de santé en cours dans les expositions accidentelles ainsi que dans leur utilisation potentielle comme un agent de menace chimique. Bien que les poumons sont la cible principale, les organes tels que le coeur et le cerveau sont également touchés ^1-3. Modèles in vivo sont généralement utilisés pour les tests de toxicité de TIC, mais des essais in vitro pour l'évaluation de la toxicité est plus simple, plus rapide et plus rentable. En modèles in vitro permettent également une enquête app....

Protocol

1. Cultures Rat cardiomyocytes

1. Toutes les expériences ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le soin des animaux et l'utilisation comité institutionnel, IACUC.
2. Obtenir des cardiomyocytes de rats du cœur (ventricules) de rats mâles (240-260 g) en utilisant des méthodes décrites précédemment ^4. En bref, anesthésier les animaux en utilisant une injection intrapéritonéale de pentobarbital (100 mg / kg; confirmer l'anesthésie par la méthode de pincement de l'orteil), puis retirez le cœur en 10,0 ml, 1 mM de Ca ^{2 +} contenant un tampon Krebs Ringer, pH 7,4.
3. Rincer les coeurs 5-6x pour enlever le ....

Results

Tige principale cardiomyocytes forme attachent sur ​​des matrices de laminine et se propagent et se différencient en cultures confluentes (figure 1A et son encart). Ces cellules ont été en outre caractérisés sur la base de l'actine et de l'expression de sarcomère SERCA2 (Figures 1B et 1C). cardiomyocytes de rat sont très sensibles à la toxicité du chlore en tant que 15 minutes d'exposition à 100 ppm de chlore a causé des arrondissement des cellules et la mort dans des c.......

Discussion

Le type le plus commun des expositions toxiques aigus se produit lorsque l'on respire un produit chimique toxique dans les poumons. Ces produits chimiques peuvent aussi être prises rapidement dans la circulation sanguine et peuvent avoir un impact d'autres organes tels que le cerveau et le cœur. Toxicité à l'inhalation de divers agents utilisant des modèles animaux sont étudiés et largement rapporté, mais les mécanismes sont moins bien compris. Il s'agit d'un obstacle majeur dans le développement de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan	Laboratories Sprague-Dawley  ;
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlore	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit  ;	Promega	G8091
Voltohmmètre épithélial et électrode baguette	World Precision Instruments	EVOM et STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
Crépine à cellules en nylon de 70 microns	Corning	#352360
Chambres de bioconfinement en polysulfone  ;	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Anticorps anti-actine sarcomérique	Abcam Cambridge, MA	ab28052
Anticorps SERCA2	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Anticorps Ki-67	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Anticorps secondaire conjugué à Alexa 488	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Créatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protéase	Sigma-Aldrich	P5147
Collagénase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Solution de sonnette lactée	Abott Laboratories	7953
Sérum d’âne	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, solution saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich	D1408
4-15 % gels SDS-PAGE	Bio-Rad	456-1083
Membrane nitrocellulosique	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween  ;	Sigma-Aldrich	P1379
Kit de détection de la peroxydase	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Média de montage, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Citrate de sodium	Sigma-Aldrich	71497
Collagène	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Pénicilline/streptomycine	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ