선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화
Summary
선형 증폭 중재 (LAM)-PCR은 게놈에 바이러스 벡터를 통합의 정확한 위치를 식별하기 위해 개발 된 방법입니다. 이 기술은 유전자 치료 환자 등 새로운 벡터 기술, T-세포의 다양성, 암 줄기 세포 모델의 바이오 안전성에 클론 역학을 공부하는 우수한 방법으로 진화하고있다
Abstract
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.
Introduction
선형 증폭 PCR (LAM-PCR)을 매개하는 모든 근원의 알려진 DNA에 인접한 알 수없는 측면에서는 DNA를 식별하고 특성화 할 수 있습니다. 보다 구체적으로, LAM-PCR은 숙주 게놈 내에서 1,2 (IS) 바이러스 벡터의 삽입 부위를 집중하기 위해 개발되었다. 레트로 바이러스 나 트랜스포존과 같은 유전 적 요소는 (반) 임의의 방식 3-6 호스트 게놈에 자신의 게놈을 통합 할 수 있습니다. 많은 경우에 이러한 벡터가 통합 정확하게 위치를 알고 결정적이다. LAM-PCR은 결찰 매개 PCR 7 및 그 변종 또는 역 PCR 8와 같은 대체 기술에 우수한 것으로 입증되었습니다. 이 방법의 감도와 견고성은 벡터 게놈 접합 증폭 PCR 제품의 자기 선택의 최초의 프리 앰프에서 발생한다. 언급 된 다른 방법과 마찬가지로, LAM-PCR은 9-11의 검색 능력에 편견을 도입, 제한 효소의 사용에 의존한다. 따라서,IS 레퍼토리 (integrome)의 서브 세트 만이 하나의 반응에서 검출 될 수있다. 이 바이어스는 제한 효소 (9)의 최적의 조합을 사용하여 주어진 샘플의 병렬 분석을 통해 최소화된다. 최근 기술의 변형은 제한 효소의 사용을 우회 한 번의 반응 9,12있는 샘플의 공정한 게놈 넓은 해석을 허용하는 LAM-PCR (nrLAM-PCR)이 개발되었다 비 제한 칭했다.
과거에는, LAM-PCR은 원인 레트로 바이러스가 유전자 치료 임상 시험 13 ~ 15에서 몇 환자에서 백혈병에 상승을주고 식별하는 데 사용되었습니다. 그 이후로, LAM-PCR을 식별하기에 적합 한 다른 통합 벡터 (렌티 바이러스 벡터, 트랜스포존) 또한 수동적으로 아데노 – 관련 벡터 (AAV) 또는 인테그라 불량 렌티 바이러스 벡터 (IDLV)와 같은 벡터를 통합하는 통합 패턴을 식별 할 수에서 (16) -21. LAM-PCR의 응용 프로그램은 광범위한 확산되어 기존의LY,이 기술은 널리 유전자 치료를받은 환자에서 유전자 변형 세포의 클론 구성을 공부하거나 통합 문제 15,16,22-24을 탈피하여 새로운 벡터 시스템의 바이오 안전성을 평가하는 데 사용됩니다. 최근, LAM-PCR은 IDLV 트래핑 분석 (25)에 의해 특이 디자이너 클레아의 오프 대상 활동을 결정하는 사용.
또한, LAM-PCR 쉽게 유기체에서 시간이 지남에 형질 세포의 운명을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토 암 유전자뿐만 아니라 종양 억제 유전자를 확인하고 또한 조혈 또는 암 줄기 세포 생물학 26-28을 연구 할 수 있습니다. 마지막으로 적어도, LAM-PCR은 인간 29 (및 게시되지 않은 데이터)에 T-세포 수용체의 다양성을 연구하기 위해 적응했다.
기술의 본질적인 힘은 단일 염기 R과 함께 알 수없는 측면에서는 DNA의 수백만의 특성을 허용 깊은 시퀀싱 기술과 방법을 연결하여 강화전체 게놈의 esolution. 다음과 같은 프로토콜에서, 우리는 단계별로 증폭 및 렌티 바이러스 벡터입니다 확인하는 예시 적으로 알 수없는 DNA를 측면에서는 식별을 설명합니다. 프로토콜에 사용 된 올리고 뉴클레오티드. 어떤 소스의 추출 된 DNA 또는 cDNA를이 LAM-PCR 및 nrLAM-PCR을위한 DNA 템플릿으로 이용 될 수는 표 1에 나타내었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
LAM-PCR 기술은 공지 된 DNA 영역의 측면 불명 DNA 서열을 식별한다. 때문에 공지 된 DNA 서열에 특이 적 프라이머의 혼성화와 접합부의 증폭 량으로 인해 고감도, 그것은 단일 세포 수준까지조차 희귀 접합을 증폭 및 검출 할 수있다. 반대로, 클론 상황에서 LAM-PCR은 하나의 반응에 다른 접합의 수천을 증폭 할 수 있습니다.
그러나, 제한의 사용으로 인해이 integrome 만 하위 성분마다…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1 % wt/vol BSA |
| 6M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96 well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
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