Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons
Summary
Ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs), um die Bild einzigen entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen verwendet werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung RBMBs in Zellen von Mikroporation und fluoreszierende Abbildung einzelner RNA-Transkripte in Echtzeit.
Abstract
Die Erkenntnis, daß sowohl die räumliche und zeitliche Regulierung der Genexpression kann wichtige Auswirkungen auf die Zellfunktion haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt, einzelne RNA-Transkripte in einzelnen lebenden Zellen sichtbar. Eine vielversprechende Technik, die kürzlich beschrieben wurde, verwendet eine Oligonukleotid-basierten optischen Sonde, ratiometrisch bimolekularen Bake (RBMB), um RNA-Transkripte, die entworfen wurden, um mindestens vier Tandemwiederholungen der RBMB Zielsequenz in der 3'-untranslatierten Region enthalten, zu detektieren. RBMBs sind speziell entwickelt, um ein helles Fluoreszenzsignal bei Hybridisierung an komplementäre RNA emittieren, aber ansonsten bleiben abgeschreckt. Die Verwendung einer synthetischen Sonde bei diesem Ansatz können photo, rot-verschoben und stark emittierenden organischen Farbstoffen für die Bildgebung verwendet werden. Bindung von mehreren RBMBs zu den technisch RNA-Transkripte Ergebnisse in diskreten Fluoreszenzflecken, wenn sie unter einer Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop. Folglich wird die Bewegung der einzelnen RNA-Transkripte können ohne weiteres in Echtzeit, indem sie eine Zeitserie von Fluoreszenzbildern dargestellt werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung in Zellen durch Mikroporation und Live-Cell-Imaging von einzelnen RNA-Transkripte.
Introduction
Die Expression und Regulation von RNA-Transkripten ist ein komplexer und dynamischer Prozess, der im Wesentlichen zur Steuerung des Zellverhaltens und Schicksal verantwortlich ist. Obwohl die Bedeutung von RNA diktieren Zellfunktion ist seit einiger Zeit bekannt ist, ist es oft schwierig, klare Verbindung zwischen den beiden, da die meisten RNA-Analyse-Tools nicht über die räumliche und zeitliche Auflösung, um wichtige regulatorische Ereignisse wie Transkriptions Platzen zu erfassen, RNA zeichnen Menschenhandel und lokalisierte RNA-Prozessierung. Dies hat zu der Einführung von mehreren Techniken, die einzelnen RNA-Transkripte in lebenden Zellen in Echtzeit visualisiert 1 geführt werden kann. Vielleicht das bekannteste dieser Verfahren verwendet eine GFP-MS2-Fusionsproteins an RNA, die konstruiert wurde, um Tandem-Wiederholungen des MS2-Bindungsstelle in der 3'-UTR-2,3 enthalten Ziel. Indem mehrere GFP-Moleküle in der Nähe, individuelle RNA-Transkripte als helle fluoreszierende Fleckendurch Fluoreszenzmikroskopie. Das GFP-MS2-System beispiellosen Einblick in RNA Verhalten, einschließlich direkte Visualisierung und Messungen der Transkriptions platzen 4,5, Erkennung von einzigartigen Unter zelluläre Lokalisation und Verarbeitung 6-9, und Echtzeit-Bildgebung von RNA-Transport 10 vorgesehen. Doch trotz der enormen Potenzial des GFP-MS2-System, ungebundenen GFP-MS2-Fusionsproteine können eine hohe Hintergrundfluoreszenzsignal, die die Vielseitigkeit und Dynamik dieser Technik begrenzt erstellen. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um dieses Hintergrundsignal zu begrenzen, einschließlich subzelluläre Kompartimentierung von ungebundenem GFP-MS2 10, Proteinfragments Komplementierung 11 und alternative RNA-Bindeproteinen und Ziele 12. Jedoch sind alle diese Ansätze bleiben empfindlich gegenüber der relativen und gesamten Expression der Ziel-RNA und GFP-MS2-Fusionsprotein.
Als einlternative den GFP-MS2-Systeme haben MBs ebenfalls verwendet, um RNA-Transkripte mit gentechnisch Tandemwiederholungen der komplementären Bindungsstelle in der 3'-UTR 13,14 detektieren. Molecular Beacons sind Haarnadel bildenden Oligonukleotid-Sonden, die an einem Ende mit einem Quencher, und am anderen Ende mit einem fluoreszierenden Reporter markiert sind. Wenn sie nicht an das Ziel gebunden RNA des fluoreszierenden Reporter und Quencher in unmittelbarer Nähe bleiben, was zu einem Nieder fluoreszierenden Zustand. Nach der Hybridisierung werden die fluoreszierenden Reporter und Quencher auseinandergedrückt und die Fluoreszenz wiederhergestellt wird. Ähnlich der GFP-MS2 System die Bindung von mehreren molekularen Beacons auf eine einzige RNA-Transkript ergibt einen hellen fluoreszierenden Flecks, die durch Fluoreszenzmikroskopie identifiziert werden kann; Jedoch wird erwartet, dass die Hintergrundfluoreszenz zu viel niedriger aufgrund des abgeschreckten Konfiguration ungebundenen Molecular Beacons. Leider, trotz der geschickten Aktivierungsmechanismus, der in den m eingebaut istMOLEKULARE Leuchtfeuer-Design, gibt es jetzt immer mehr Hinweise, die Molecular Beacons unhybridisiert nicht in der Haarnadel-Konformation bleiben, wenn in lebende Zellen eingebracht. Daher erzeugen sie ein falsch-positives Signal, dass das Signal-zu-Hintergrund deutlich reduziert. Um diesen Nachteil zu überwinden, haben wir vor kurzem eine neue synthetische Sonde für die Bildgebung RNA in lebenden Zellen, ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs; 1A) 15,16. RBMBs aus zwei 2'-O-Methyl-Oligonukleotid-Stränge, die eine Hybridstruktur mit Eigenschaften von sowohl kurze Haarnadel-RNA (shRNA) und Molecular Beacons bilden zusammen. Die Schleife und Fluoreszenzaktivierungsmechanismus ist ähnlich zu dem molekularen Leuchtfeuer, während die lange doppelsträngige Domäne mit einem 3'-Überhang UU ist charakteristisch shRNA. Die shRNA Features wurden entwickelt, um Kernexport, die wir steigt auf> 24 h gefunden intrazellulären Lebenszeit, mit minimalen beobachtbaren Verschlechterung zu fahren, undverhindert unspezifischen Öffnung der Schleife. Als Ergebnis RBMBs eine signifikant höhere Signal-zu-Hintergrund als Molecular Beacons.
Es sei darauf hingewiesen, dass RBMBs nicht unter Verwendung von DNA-Oligonukleotiden, da DNA-Sonden auf der Basis nicht die gleichen Kernexportfunktionen als RNA-basierten Sonden besitzen. Strukturell ist das RBMB Schleife in der Regel für 15 bis 21 Basen lang sein, um ein Gleichgewicht zwischen Spezifität und Selektivität bei der RNA-Hybridisierung zu schaffen. Der kurze Schaft, der aus den beiden Selbst komplementären Domänen bildet, wird in der Regel entwickelt, um 4 Basen sein. Wenn ein längerer Schaft ausgewählt wird, wird die Geschwindigkeit der Hybridisierung zwischen der RBMB Schleife und Ziel-RNA deutlich verlangsamt 17,18. Umgekehrt ist die Schmelztemperatur, wenn eine kürzere Schaft-Sequenz ausgewählt ist oft zu gering, um die Stamm-Schleifen-Struktur bei 37 ° C aufrecht zu erhalten, was zu einer hohen Hintergrundsignal. Die Spezifität der RBMB auch rotuced als die Stammlänge verkürzt. Da die Reihenfolge der RBMB Stamm-Schleifen können RBMB Leistung beeinflussen, muss sorgfältig ausgewählt werden, 19. Insbesondere sollte ideal Loop-Sequenzen minimal Sekundärstruktur haben, hybridisieren mit RNA-Sequenzen mit minimalen Sekundärstruktur, Proteinbindungsstellen zu vermeiden, und vermeiden Off-Target-Bindung. Vorhersagen der beiden RBMB und RNA-Sekundärstruktur kann mit einer Software wie mfold 20 erhalten werden. Ergänzende Off-Target-Websites identifiziert mit Hilfe eines Nukleotid-Basic Local Zuordnung Search Tool (BLAST). Jedoch wegen der Unstimmigkeiten in den Modellvorhersagen und der Schwierigkeit bei der Identifizierung von Protein-abwartend Websites, die Spezifität aller RBMBs letztlich experimentell validiert werden.
Falls gewünscht, kann ein ungestillt Referenzfarbstoff, die unempfindlich gegenüber dem Hybridisierungszustand ist auf die RBMB 15 hinzugefügt werden. Die Zugabe eines Referenzfarbstoffs PROVIDE einen Marker für Sonde Lieferung und ratiometrische Bildgebung verwendet werden, wenn genauere Messungen des gesamten zellulären Fluoreszenz erforderlich sind. Die Bezugs Farbstoffen ermöglicht Messungen, um Unterschiede im Hintergrund aufgrund von Zelle zu Zelle Schwankungen in der Abgabe eingestellt werden. Wenn jedoch die Abbildung einzelnen RNA-Transkripte der Referenzfarbstoff ist nicht erforderlich. Bemerkenswert ist, können einige Referenz Farbstoffe mit dem Export von RBMBs aus dem Zellkern stören, was zu einem etwas höheren Hintergrundsignal in den Zellkern.
Wenn sie richtig ausgelegt ist, kann RBMBs für Bild in einzelne RNA-Transkripte in einzelnen lebenden Zellen verwendet werden, wenn die Ziel-RNA wurde entwickelt, um mindestens vier Bindungsstellen RBMB (Abbildung 1B) 16 enthalten. RBMBs wirksam in einer Vielzahl von Zelltypen über Mikroporierung keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen 21 zugeführt werden, mit wenig, und quantitative Messungen der Genexpression kanninnerhalb von 30 min gewonnen. Darüber hinaus ist die Methode relativ unempfindlich RBMB Konzentration und Ziel-RNA-Niveaus, da die Fluoreszenz von ungebundenem RBMBs wirksam gequencht. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung der Methodik herzustellen und zu reinigen RBMBs, sowie ein allgemeines Verfahren für die Lieferung von RBMBs in den Live-Zellen über Mikroporation und die Abbildung der einzelnen RNA-Transkripte in Echtzeit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fähigkeit, einzelne Bild entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen mit einem konventionellen Weitfeldmikroskop erfordert eine helle und photoFluoreszenzSignal mit jedem RNA-Transkript und eine niedrige Leuchtstoff Hintergrund von ungebundenen Fluoreszenzsonden ausgeh zugeordnet werden. In diesem Verfahren wird ein helles Fluoreszenzsignal durch Hybridisierung mehrere (bis zu 96) auf Oligonukleotiden basierende Fluoreszenzsonden, dh RBMBs, auf jedes RNA-Transkript erreicht. Allerdings sind nur vier Bind…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Career Award (0953583) und dem National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 unterstützt.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
