관련 원리를 조사하고 형광 항체 타겟 조건의 다수와의 호환성을 입증하여 발광 (연료)에서 언 바운드 흥분에 의한 형광의 기초 및 응용 성을 확장.
발광 (연료)에서 언 바운드 흥분에 의해 형광이 시험 관내 및 생체 내에서 증가 된 신호와 대비 향상을 생산하는 복사 여기 방출하는 과정입니다. 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛), 아직 같은 기본 원칙의 많은 연료의 주가는 크게 발광 소스와 형광 실체 사이의 허용 작업 거리에서 다르다. BRET 효과적으로 2 배 포스터 반경 일반적 미만 14 ㎚의 최대로 제한되지만, FUEL은 광 흡수체의 부재 μM까지의 거리에서 또는 심지어 cm 발생할 수있다. 여기에서 우리는 현상 뒤에 관련 원칙을 검토하여 연료의 기초와 응용을 확장하고 형광체 및 형광 나노 입자의 다양한과의 호환성을 보여줍니다. 또한, 항체 대상 연료의 유틸리티를 탐구한다. 여기에 나타낸 예는 FUEL가 APPL 위해 이용 될 수 있다는 증거를 제공브레 브레 전통 전체 동물 영상 사이에 존재하는 공간 빈 공간을 채우는 수 없습니다 ications.
바이러스 1, 2, 박테리아 3, 작은 포유 동물 등의 생물의 유전 적 변형은 4 유도 또는 구조적으로 표현 생물 발광 하나에 매우 성공적 널리 5-7 보여 주었다. 생물 발광, 자연적으로 발생하는 시약을 포함하는 생체 내 화학 발광 반응은 외부 광원에 대한 필요없이 광을 생성하는 장점을 갖는다. 이와 같이, 생물 발광 이미징 형광 이미징 8 찾았 자동 비특이적 신호의 일반적인 단점 고통받지 않는다. 감지 된 신호가 의도 된 소스로부터 유래 전적으로 이후 결과적 생물 발광은 상당한 신호 대 잡음비를 갖는다. 많은 모델은 생체 외 및 생체 내 응용 프로그램 9에 Photorhabdus의 luminescens에서 럭스 오페론 (480 및 490 nm의 사이에서 중심 최대 발광)을 이용하고 있지만, 작은 mamm에서의 사용루게릭 병으로 인해 이미징 조건의 본질에 문제가있다; 광학 헤모글로빈 등의 흡수, 이러한 조직과 뼈 등의 산란 제의 파고 드는 존재가 강하게 노란색 파장 3 파랑에 영향을줍니다. 설계 반딧불 루시 페라 제 (최대 발광 617nm에서)의 발현은 최근 크게 광 흡수 (10)을 극복하지만, 여전히 영향을 산란 될 수있는 도구를 제공하고, 개발 및 통합되었습니다.
응답에서, 빨간 이동 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛) 11 ~ 13을 사용하여, 650-900 nm의 최소화 흡수 및 분산의 영역의 원하는 광학 창에 방출 된 신호를 여러 시도가 있었다. 신호 검출을 향상시키는 도구로서뿐만 셉터와 도너 형광 추가로 생물 발광 소스를 사용 BRET은 제한된 성공을 발견했다. 이 현상의 정액 예를 들어, "자기 조명 양자 도트로4; (SIQDs) (14)로 구성되어 닐라 외부 폴리머 라이신 층에 바인딩 luciferases를 레니 포르 미스 수정 의 상용 양자 도트 (양자점). 기질을 첨가 할 때, 얻어진 발광 생물 반응 레드 광자의 상당한 생산을 생성 양자점에서 형광 방출을 유도한다. 그러나 이러한 SIQDs는 생리 학적으로 관련 이벤트의 생체 내 시각화에 적용을 제한했다. 이 제한된 적용 가능성으로 인해 SIQDs이 유전자에 의해 코딩 될 수없고, 따라서 폴리머 외피의 이차 변형을 요구하기 때문에, 기관, 세포 또는 그 유전자에 이중 프로브를 연결하는 어려움 쉽다. 적용 가능성을 개선하기 위해, luciferases가 발광 코어에 직접 결합되어 대안 SIQDs는 최근 15 사용되어왔다. SIQD 개념의 오프 구축, 더 적용 BRET 시스템에에 Cypridina 루시 페라 제를 부착하여 달성되었다675 nm의 460 nm의에서 상당한 빨간 변화를 생산하면서 구체적으로 마우스에서 종양을 표적으로 할 수 있었다 염료 16, docyanine. 비 복사 에너지 전달을 받아야하는, 브렛은 형광 대응과 같은 기본 제약 조건을 다음과 기증자 방출 및 수용체의 여기 스펙트럼 두 부분 사이의 작동 거리 사이에 강한 스펙트럼 중첩이 있어야의 순서에 있어야합니다 포스터 반경 (5-14 nm의 두 번 포스터 반경 (17)의 효과가 최대 거리로, 기증자 수용체 쌍에 따라 다름). 이 거리는 의존성이 크게 검출을 향상시키기위한 수단으로 BRET을 사용하여 관찰 할 수있는 이벤트의 종류를 제한한다.
최근 새로운 접근은 시험 관내 및 생체 내 조건에서 모두 확인되고 아래에서 증명되었다. 브렛, 발광 (연료)에서 18, 19 언 바운드 흥분에 의한 형광의 기반을 구축 </suP> 또한 발광 및 형광 구성 요소 사이에 강한 스펙트럼 중첩이 필요합니다. 그러나, BRET 달리 FUEL는 발광 원으로부터 방출 된 광자는이어서 형광 양자 수율에 따라 적색 편이 된 광자를 방출 광학적 접근 형광 물질에 의해 흡수된다 완전히 복사 과정이다. BRET에 가깝다,이 접근법은 또한 광 흡수제의 존재 촬상의 제약을 극복하기 위해 사용될 수있다. 생성 된 적색 이동으로 인해 감쇠의 감소 및 광 산란 효과의 감소로 검출 된 신호의 전반적인 증가와 특이도를 제공한다. FUEL은 럭스 오페론과 양자점 (18, 19)을 발현하는 생물 발광 대장균 사이에서 발생하는 것으로보고되었다. SIQDs에 실험적으로 유사하지만, 근본적인 차이가 존재합니다 : 발광 소스가 fo를 수있는 형광, 물리적으로 결합 될 수 있도록 연료, 그것은 필요가 없습니다형광 프로브의 유전자 인코딩을 r에. 인해 발광 박테리아와 양자점 사이 FUEL의 성공적인 검출에,이 기술은 표면 (피부)와 깊은 조직 (폐, 간) 등 포도상 구균 폐렴 Klebsiellia 같은 감염 모두에 적용 할 수있는 가능성이있다.
실험적인 의미의보고 이래, FUEL 수락 발광 및 형광 쌍을 예측하는데 사용될 수있는 강력한 수학적 모델 (20)을 포함하도록 진화하고 있으며, 그 응용은 양자 수율이 같은 광 물리 특성의 식별에 사용을 포함하도록 확장 하였다. 우리는 연료의 기본 기술의 몇 가지 아래에 설명합니다. 첫째, 우리는 짧은 (μm의) 긴 (cm) 모두에 근본적으로 BRET에서 연료를 구별하는 작업 거리를,이 현상에 대한 증거를 보여줍니다. 둘째, 우리는 형광 물질과 형광 나노 입자의 다양한 검사하여 가능한 연료 쌍을 확장. THIRD는, 연료 응용 프로그램은 대상 및 비 대상 연료 쌍을 비교하여 조사 하였다.
FUEL의 근본적인 데모 단순히 형광 나노 입자 또는 양자점으로 발광 박테리아를 혼합함으로써 달성 될 수있다. 두 기관은 물리적으로 분리하고 효율적인 RET 거리 이상으로 유지 될 것입니다. 더 어려운 관내 및 생체 내에서 모두 FUEL 신호 최적화이다. 시험관 조건에서로하고, 광 흡수가없는 상태 모두, 보통 과량 형광 물질의 첨가는 FUEL 응답을 최대화하기에 충분한 것이다. 그러나, 정적 또는 충돌하는 작은 담금질 높은 농도의 현상에서 형광 신호의 손실로 이어질 수 있습니다. 독립적으로 발광 소스 및 형광 물질의 농도를 변화시킴으로써, 일련의 희석을 수행하는 것은 원하는 농도를 최적화하는 것을 도울 것이다. 생체 내 농도 하에서 확립하고 FUEL의 최적화는 더 어렵고 사례별로 해결 될 필요가있다. 그것은 공동을 생성하기가 어려울 수있다ndition 형광 실체 발광 소스에 의해 광학적으로 액세스 할 수있는. 이와 같이, 2 개의 잔기에 직접 공동 주사로 시작하는 것은 최적의 조건 하에서 FUEL의 성공에 관한 정보를 제공 할 수있다.
표준 프로토콜은 알렉사 시리즈와 양자점과 같은 형광 실체와 라벨 박테리아와 진핵 세포에 존재한다. 종종이 감소 세포 생존 또는 변경 신진 대사 활동과 같은 원치 않는 효과로 이어질 수 항체 표면 기능화 또는 활성화가 필요합니다. 이것을 극복하기 위해, 항체 또는 활성화 제의 최적 량은 형광 라벨을 최대화하면서, 즉 셀룰러 교란을 최소화하는 데 필요한 결정하는 것이 중요하다. 양자점의 사용 때문에 그들의 특질 넓은 여기 스펙트럼 좁고 가변 방출 스펙트럼, 및 큰 스톡스 시프트의 가능성을 유익하다. 그러나 양자점은 세포 독성이 될 수 있으며, 어떤 경우에는 바람직하지 않을 수있다.
<p클래스 = "jove_content"> 연료는 많은 BRET 실험 13에 존재하고 발광 및 형광 다양한 소스에 적용 할 수있는 현상이다. 지금까지 연료에서 발생하는 광자는 비특이적 상호 작용 또는 잘못 설계된 BRET 실험으로 인한 불행한 배경 신호의 제품으로 간주되었다. 그것은 우리가 원하지 않는 신호의 유틸리티를 식별 할 수 있었다 여기에서 입증 실험의 종류 만입니다. 도시 된 예에서는 발광 박테리아가 형광 실체의 다양한 표준 형광 반응을 도출 할 수있는 확산 여기 원으로서 작용한다. 또한, 인해 실질적인 작동 거리, 그것은 연료 BRET의 발생없이 구성 될 수 있지만, 일반적으로 BRET 연료에서 기여하지 않고 관찰 할 수 없다는 결론을하는 것이 안전합니다. 중요한 인해 표적 요건의 부족, FUEL는 BRET 및 C 사이에 존재하는 간극 공간을 커버하는 데 사용할 수onventional 전체 – 동물 이미징 기술.The authors have nothing to disclose.
저자는 JD, AH로 ((SLS에), EU-FP7 프로그램 "자동화", 문화원 카르노 프로그램 11 (JD, CS, CS에) 뉴욕의 파스퇴르 재단의 재정 지원에 대한 감사의 뜻을 연장하고 싶습니다 , AR, RT, SLS) 및 RT, SLS에 프로젝트 IMNOS (), 코니 – 하루 뒤에 자선 재단 (SLS), 분자 이미징의 유럽 석사 (IT로), 지역 일드 프랑스 (France) 프로그램 MODEXA (SLS), 참깨 (SLS) 및 DimMalInf (SLS, RT), Biologie – 상테 엔 ANR 프로그램 그랑 Investissement 드 난 Avenir에서 인프라 Nationales : 프랑스 LifebioImaging (FLI) 프랑스 생활 이미징 (RT, SLS), 프랑스 (France) 바이오 이미징 (JD, SLS) 및 파스퇴르 연구소, 파리. 또한, 저자는 시약을 위해, 호세 Bengoechea과 허버트 슈바이처에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한, 저자는 항체를 생성 신디 Fevre에게 감사의 말씀을 전합니다.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |