Utvide grunnlaget og anvendbarhet av fluorescens ved Unbound Eksitasjon fra luminescens (drivstoff) med å kartlegge de relevante prinsipper og demonstrere sin kompatibilitet med en rekke fluoroforene og antistoff-målrettet forhold.
Fluorescens ved Unbound Eksitasjon fra luminescens (drivstoff) er et strålingspådriv eksitasjon-utslipp prosessen som produserer økt signal og kontrastoppladning in vitro og in vivo. DRIVSTOFF deler mange av de samme underliggende prinsipper som Bioluminesens Resonance Energy Transfer (BRET), men skiller seg mye i de akseptable arbeidsavstander mellom selvlysende kilde og fluorescerende enhet. Mens BRET er effektivt begrenses til maksimum to ganger Förster radius, vanligvis mindre enn 14 nm, kan FUEL oppstå ved avstander opp til mikrometer eller enda cm i fravær av en optisk absorber. Her vi utvide på grunnlaget og anvendbarhet av FUEL ved å gjennomgå de relevante prinsippene bak fenomenet og demonstrere sin kompatibilitet med et bredt utvalg av fluoroforene og fluorescerende nanopartikler. Videre er nytten av antistoff-målrettet FUEL utforsket. De som er vist her eksempler gir bevis for at FUEL kan utnyttes for Applications der BRET ikke er mulig, fylle den romlige tomrommet som eksisterer mellom BRET og tradisjonelle hele dyr bildebehandling.
Genmodifisering av organismer, som virus 1, 2, bakterier tre, eller små pattedyr fire til enten indusere eller konstitutivt uttrykte Bioluminescens, har vært svært vellykket, og mye viste 5-7. Bioluminescence, en in vivo kjemiluminescerende reaksjon som involverer naturlig forekommende reagenser, har fordelen av å produsere lys uten bruk av en ekstern lyskilde. Som sådan, bioluminescent avbildning ikke lider av de vanligste ulemper ved auto-og ikke-spesifikt signal ble funnet fra fluorescens-avbildning 8.. Følgelig har bioluminescens et betydelig signal-til-støy-forhold, siden en hvilken som helst detektert signal stammer utelukkende fra den tiltenkte kilden. Mens mange modeller har utnyttet lux operon fra Photorhabdus luminescens (maksimal emisjon sentrert mellom 480 og 490 nm) for in vitro-og in vivo-applikasjoner 9, dens bruk i små mammals har vært problematisk på grunn av selve innholdet av imaging forhold; pervading eksistensen av optiske absorbenter, slik som hemoglobin, og spredningsmidler, så som vev og bein, sterkt påvirker blå til gul 3 bølgelengder. Ekspresjon av en konstruert ildflue luciferase (maksimum emisjon ved 617nm) er nylig blitt utviklet og tatt, noe som gir et verktøy som i stor grad overvinner optisk absorpsjon 10, men er fremdeles gjenstand for spredningseffekter.
Som svar, har det vært flere forsøk på å rød-skifte den slippes ut signalet til den optiske vinduet på 650-900 nm, en region av minimert absorpsjon og scatter, bruker Bioluminescens resonans energioverføring (BRET) 11-13. Som et verktøy for å forbedre signaldeteksjon, Bret, som bruker en bioluminescent kilde som donor og en tilleggs fluoroforen som akseptor, har funnet begrenset suksess. Som en banebrytende eksempel på dette fenomenet, "selvlysende kvanteprikker4; (SIQDs) 14 består av modifisert Renilla reniformis luciferases bundet til den eksterne polymer-lysin lag av kommersielt tilgjengelig kvanteprikker (QDs). Ved substrat tillegg induserer den resulterende bioluminescent reaksjons fluorescensemisjon fra QDs, genererer en betydelig produksjon av røde fotoner. Imidlertid har disse SIQDs begrenset anvendbarhet for in vivo synliggjøring av fysiologisk relevante arrangementer. Denne begrensede anvendbarhet er sannsynlig på grunn av vanskeligheten med å knytte den doble probe til organet, cellen eller genet av interesse, ettersom de SIQDs ikke kan genetisk kodet og vil derfor kreve en sekundær modifisering av polymer-skall. For å forbedre deres anvendbarhet, alternative SIQDs, hvor luciferases er bundet direkte til den luminescerende kjernen, har nylig blitt benyttet 15. Bygge ut av SIQD konseptet, ble et mer aktuelt BRET system oppnådd ved å koble Cypridina luciferase til en idocyanine fargestoff 16, som var i stand til spesifikt rettet mot tumorer i mus mens produsere en betydelig red overgangen fra 460 nm til 675 nm. For å gjennomgå en ikke-strålingsenergi-overføring, slik Bret de samme primære begrensninger som den fluoriserende motstykke: det må være en sterk spektral overlapping mellom donor-og akseptor-utslipp magnetisering spektra og arbeidsavstanden mellom de to molekyldelene må være i størrelsesorden av Förster radius (5-14 nm, avhengig av donor-akseptor-par, med en effektiv maksimal avstand på to ganger Förster radius 17). Denne avstanden avhengighet i stor grad begrenser hvilke typer hendelser som kan observeres ved hjelp BRET som et middel til å forbedre gjenkjenning.
Nylig ble en ny tilnærming ble identifisert og demonstrert under både in vitro og in vivo-betingelser. Bygging av grunnlaget for BRET, fluorescens etter Unbound Eksitasjon fra luminescens (FUEL) 18, 19 </sup> krever også en sterk spektral overlapping mellom selvlysende og fluoriserende komponenter. Imidlertid, i motsetning til Bret, er FUEL et helt strålingen prosess hvorved den avgitte foton fra den luminescerende kilden blir absorbert av et optisk tilgjengelig fluorofor, som deretter avgir et rødt forskjøvet foton i henhold til fluoroforen kvanteutbytte. Akin til BRET, kan denne tilnærmingen også brukes til å overvinne begrensninger av bildebehandling i nærvær av optiske dempere. Den resulterende røde forskyvning gir en generell økning, og spesifisitet i det detekterte signal på grunn av en reduksjon i demping og en reduksjon av optiske spredningseffekter. FUEL har blitt rapportert å forekomme mellom bioluminiserende Escherichia coli uttrykker lux operon og QDs 18, 19. Mens eksperimentelt lik SIQDs, eksisterer det en fundamental forskjell: i FUEL, er det ikke nødvendig for den luminescerende kilden for å være fysisk bundet til fluoroforen, som tillater for genetisk koding av selvlysende sonde. På grunn av den vellykkede påvisning av FUEL mellom selvlysende bakterier og QDs, er det mulig at denne teknikken kan brukes til både overfladisk (huden) og dype vev (lunge, lever) infeksjoner som Staphylococcus aureus og Klebsiellia pneumoniae.
Siden rapporten fra sin eksperimentelle betydning, har FUEL utviklet seg til å omfatte en robust matematisk modell 20 som kan brukes til å forutsi akseptable selvlysende og fluorescerende par, og dets anvendelser er utvidet til å omfatte anvendelse i identifikasjon av photophysical egenskaper som kvanteutbytte. Vi beskriver nedenfor noen av de grunnleggende teknikkene for drivstoff. Først viser vi bevis for dette fenomen over både korte (mikrometer) og lang (cm) arbeider avstander, som fundamentalt skiller FUEL fra BRET. For det andre, vi ekspandere på de mulige FUEL parene ved å undersøke en rekke fluoroforer og fluorescerende nanopartikler. Third, er drivstoff applikasjoner undersøkt ved å sammenligne målrettede og ikke-målrettede FUEL parene.
Den grunnleggende demonstrasjon av FUEL kan oppnås bare ved å blande selvlysende bakterier med fluorescerende nanopartikler eller QDs. De to enhetene vil være fysisk atskilt og forbli hinsides enhver effektiv RET avstand. Vanskeligere er det FUEL signal optimalisering både in vitro og in vivo. Under in vitro-betingelser, både med og uten en optisk absorber tilstede, som regel tilsetning av overskudd av fluoroforen vil være tilstrekkelig til å maksimalisere FUEL respons. Men ved høye konsentrasjoner fenomener som statisk eller collisional bråkjøling kan føre til et tap av fluoriserende signal. Utføre en fortynningsrekke ved uavhengig å variere konsentrasjonen av det luminescerende kilden og fluoroforen vil bidra til å optimalisere de ønskede konsentrasjoner. Etablering og optimalisering av FUEL henhold in vivo konsentrasjoner er mye mer vanskelig og må tas opp på et sak-til-sak grunnlag. Det kan være vanskelig å skape en condition hvor den fluorescerende enhet kan nås optisk av det selvlysende kilde. Som sådan, kan begynner med direkte co-injeksjoner av de to moieties gi informasjon om hvor vellykket FUEL under optimale forhold.
Standard protokoller finnes for merking av bakterier og eukaryote celler med selvlysende enheter som Alexa serien og QDs. Ofte krever dette overflaten funksjon eller aktivering med antistoffer, som kan føre til uønskede effekter som redusert celle levedyktighet eller endret metabolsk aktivitet. For å bøte på dette, er det viktig å fastslå den optimale mengde av antistoff eller aktiveringsmiddel som trengs som reduserer cellulære forstyrrelser samtidig maksimere det fluorescerende merking. Bruken av QDs er fordelaktig på grunn av deres karakteristiske brede eksitasjon spektra, smale og avstembar emisjonsspektra, og muligheten for en stor Stokes skift. Imidlertid kan QDs være cytotoksiske og kan ikke være ønskelig i enkelte tilfeller.
<pclass = "jove_content"> FUEL er et fenomen som er til stede i mange BRET eksperimenter 13 og kan anvendes på en rekke selvlysende og fluorescerende kilder. Fram til nå har de fotoner som følge av FUEL regnes som produkt av ikke-spesifikke interaksjoner eller en uheldig bakgrunn signal som følge av dårlig utformet BRET eksperimenter. Det er bare med typen av eksperimenter demonstrerte her at vi var i stand til å identifisere nytten av denne uønskede signal. I de viste eksemplene er luminescerende bakterie opptrer som en diffus eksitasjon kilde i stand til å utløse en standard fluoriserende respons fra en rekke forskjellige fluorescerende enheter. Videre, på grunn av den betydelige arbeidsavstand, er det trygt å konkludere med at selv FUEL kan konstrueres uten forekomst av Bret, generelt Bret ikke kan observeres uten bidrag fra BRENNSTOFF. Viktigere, på grunn av mangelen på en målsøkende krav, FUEL kan benyttes til å dekke den romlige gap som eksisterer mellom Bret og conventional hel-dyr avbildningsteknikker.The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å utvide sin takknemlighet for økonomisk støtte fra Pasteur Foundation of New York (til JD, CS, CS), EU-FP7 Program "Automation" (til SLS), Institut Carnot Program 11 (til JD, AH , AR, RT, SLS) og Prosjekt IMNOS (til RT, SLS), den Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), European Masters i Molecular Imaging (til IT), regionen Ile de France programmer MODEXA (SLS), Sesam (SLS) og DimMalInf (SLS, RT), ANR Program Grandes Invest de l'Avenir Infrastructures Nation no Biologie-Santé: Frankrike LifebioImaging (FLI) Frankrike Livet Imaging (RT, SLS), Frankrike Bioimaging (JD, SLS) og Institut Pasteur, Paris. Videre vil forfatterne takke, José Bengoechea og Herbert Schweizer for reagenser. Videre vil Forfatterne takke Cindy Fevre som genererte antistoffer.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |