Расширение основу и применимость флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топлива) по межеванию соответствующие принципы и демонстрирует свою совместимость с множеством флуорофорами и условий антител целевых.
Флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топлива) является радиационного процесс возбуждения излучения, которая производит повышенную сигнал и повышение контрастности в пробирке и в естественных условиях. ТОПЛИВО разделяет многие из тех же основных принципах, что Биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET), еще сильно отличается в приемлемых рабочих расстояний между источником люминесцентного и флуоресцентного лица. В то время как BRET эффективно ограничивается максимум 2 раза радиуса Ферстер, обычно менее 14 нм, ТОПЛИВО может произойти на расстояниях до мкм или даже см при отсутствии оптического поглотителя. Здесь мы расширяем на фундаменте и применимости ТОПЛИВА, просмотрев соответствующие принципы, лежащие в основе явления и продемонстрировать свою совместимость с широким спектром флуорофорами и флуоресцентных наночастиц. Кроме того, утилита антител, ориентированных на топливо изучены. В примерах, приведенных здесь свидетельствуют, что топливо может быть использован для заявлications где BRET не возможно, наполняя пространственную пустоту, которая существует между BRET и традиционной целого изображения животных.
Генетическая модификация организмов, таких как вирусы 1, 2, бактерий 3 или мелких млекопитающих 4 либо вызвать или конструктивно экспресс биолюминесценции, была весьма успешной и широко продемонстрировали 5-7. Биолюминесценция, хемилюминесцентный реакции в естественных условиях с участием реагентов в природе, имеет то преимущество, производя свет без необходимости внешнего источника света. Таким образом, биолюминесцентное изображений не страдает от общих недостатков авто-и неспецифической сигнала найденных из флуоресцентного изображения 8. Следовательно, биолюминесценции имеет значительное отношение сигнал-шум, так как любое обнаруженное сигнал исходит исключительно от предполагаемого источника. В то время как многие модели эксплуатировали лк оперона от Photorhabdus luminescens (максимум выбросов по центру между 480 и 490 нм) для в пробирке и в естественных приложений 9, его использование в небольшом Mammлов был проблематичным из-за самой природы условиях визуализации; пронизывает существование оптических абсорбентов, таких как гемоглобин, рассеяния агентов, таких как ткани и кости, сильно влияют синего цвета на желтый длин волн 3. Выражение сконструированного люциферазы светляков (максимум излучения на 617nm) недавно был разработан и включен, обеспечивая инструмент, который значительно преодолевает оптического поглощения 10, но все еще является предметом эффекты рассеяния.
В ответ, их было несколько попыток красное смещение излучаемого сигнала в нужную оптического окна 650-900 нм, область свернутом поглощения и рассеяния, используя биолюминесценции резонансный перенос энергии (Bret) 11-13. В качестве инструмента для улучшения обнаружения сигнала, Брет, которая использует биолюминесцентного источник в качестве донора и дополнительного флуорофором как акцептора, нашел ограниченный успех. Как семенной пример этого явления, "самоизлучающие квантовые точки4; (SIQDs) 14 состоят из модифицированного Renilla reniformis люциферазы, связанных с внешним слоем полимера-лизин коммерчески доступного квантовые точки (КТ). После подложки Кроме того, в результате реакции биолюминесцентного вызывает флуоресцентное излучение от КТ, генерируя значительную выработку красных фотонов. Однако эти SIQDs ограничили применимость в естественных условиях визуализации физиологически соответствующих мероприятий. Эта ограниченная применимость, вероятно, из-за трудности увязывания двойной зонд к органа, клетки или интересующего гена, так как SIQDs не может быть генетически закодированы, а потому потребует вторичного модификацию полимерной оболочки. Для улучшения их применимости, альтернативные SIQDs, где люцифераз которые связаны непосредственно с ядром люминесцентного, недавно были заняты 15. Строительство от концепции SIQD, более применимо система BRET было достигнуто путем присоединения Cypridina люциферазу к инdocyanine краситель 16, который был способен специально нацеленные опухолей у мышей при производстве существенную красное смещение от 460 нм до 675 нм. Чтобы пройти безызлучательной передачи энергии, BRET следует тем же первичных связей, как его флуоресцентного коллегой: там должна быть сильная спектральная перекрытие между испусканием доноров и спектров возбуждения акцептора и рабочего расстояния между двумя фрагментами должна быть порядка радиус Ферстер (5-14 нм в зависимости от пары донор-акцепторного, с эффективным расстоянии не более удвоенным радиусом Ферстер 17). Это расстояние зависимость существенно ограничивает типы событий, которые можно наблюдать с помощью Брет в качестве средства для улучшения обнаружения.
Недавно новый подход был идентифицирован и продемонстрировал в как в пробирке и в условиях естественных условиях. Строительство от фундамента Брет, флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топливо) 18, 19 </suр> также требует сильного спектрального перекрытия между люминесцентных и флуоресцентных компонентов. Однако, в отличие BRET, топливо полностью радиационного процесс, при котором излучается фотон от источника люминесцентного поглощается оптически доступным флуорофора, который впоследствии испускает красное смещение фотона в соответствии с квантовым выходом флуорофора. Родственный BRET, этот подход также может быть использован для преодоления ограничений изображений в присутствии оптических абсорбентов. Полученный красный сдвиг обеспечивает общее увеличение и специфичность обнаруженного сигнала из-за уменьшения затухания и сокращению воздействия оптических рассеяния. ТОПЛИВО, как сообщается, происходят между биолюминесцентных кишечной палочки, выражающих лк оперона и КТ 18, 19. В то время как экспериментально похожи на SIQDs, существует фундаментальное различие: в топливном, это не является необходимым для источника люминесцентного быть физически связанный с флуорофора, что позволяет FOг генетическую кодировку люминесцентного зонда. Благодаря успешному обнаружению ТОПЛИВА между светящихся бактерий и КТ, не исключено, что этот метод может быть применен как к поверхностным (кожи) и внутренних органах (легких, печени) инфекций, таких как золотистый стафилококк и Klebsiellia пневмонии.
Поскольку доклад его экспериментального значения, ТОПЛИВО стали включать надежную математическую модель 20, которая может использоваться для прогнозирования приемлемый люминесцентные и флуоресцентные пары, и ее приложения были распространены на использование в идентификации фотофизических характеристик, таких как квантовый выход. Ниже мы описываем некоторые из основных методов топлива. Во-первых, мы показываем доказательства этого явления более короткий и (мкм) и длинной (см) рабочие расстояния, которые принципиально отличает топливо из BRET. Во-вторых, мы расширяем на возможных пар ТОПЛИВА, исследуя разнообразные флуорофорами и флуоресцентных наночастиц. Thirд, ТОПЛИВО приложения исследованы путем сопоставления целевых и нецелевых пары топлива.
Фундаментальная демонстрация топлива может быть достигнуто лишь путем смешивания светящихся бактерий с люминесцентными наночастиц или КТ. Эти две организации будут физически отделены и остаются вне всякого эффективного расстояния RET. Более сложным является оптимизация сигнал ТОПЛИВА как в пробирке и в естественных условиях. В условиях ин витро, так и без оптической абсорбционной настоящее время обычно добавление избыточного флуорофора будет достаточно, чтобы максимизировать ответ топлива. Тем не менее, при высоких концентрациях явлений, например статическим или столкновительного тушения может привести к потере флуоресцентного сигнала. Выполнение серии разведений путем независимого изменения концентрации источника люминесцентного и флуорофора будет способствовать оптимизации желаемых концентраций. Создание и оптимизация ТОПЛИВА под концентраций естественных условиях гораздо сложнее и требует решения на индивидуальной основе к случаю. Это может быть трудно создать совместноеndition где флуоресцентный лицо может получить доступ оптически источником люминесцентного. Таким образом, начиная с прямого сотрудничества инъекций двух фрагментов может предоставить информацию относительно успеха ТОПЛИВА при оптимальных условиях.
Существуют стандартные методики для маркировки бактерий и эукариотических клеток с флуоресцентными лиц, таких как серии Alexa и КТ. Часто это требует поверхности функционализации или активации с антителами, что может привести к нежелательным эффектам, как снижение жизнеспособности клеток или измененного метаболической активности. Чтобы преодолеть это, важно определить оптимальное количество антител или агента активации необходимо, что сводит к минимуму сотовой возмущения, максимизируя флуоресцентных меток. Использование КТ выгодно из-за их характерно широком спектре возбуждения, узким и перестраиваемого эмиссионных спектров, а также возможность большого сдвига Стокса. Тем не менее, КТ может быть цитотоксическое и не может быть желательным в некоторых случаях.
<pкласс = "jove_content"> ТОПЛИВА это явление, которое присутствует во многих экспериментах BRET 13 и применим к различным люминесцентных и флуоресцентных источников. До сих пор, фотоны в результате использования топлива считались продуктом неспецифических взаимодействий или несчастного фонового сигнала в результате плохо спланированных экспериментов BRET. Это только с виду эксперименты показали здесь, что мы были в состоянии идентифицировать полезность этого нежелательного сигнала. В показанных примерах, люминесцентные бактерии действуют как диффузный источник возбуждения способны вызывать стандартный флуоресцентный отклик от самых разнообразных флуоресцентных лиц. Кроме того, в связи с существенным рабочим расстоянием, можно с уверенностью сделать вывод, что в то время как топливо может быть построена без возникновения BRET, в общем BRET не могут наблюдаться без вклада ТОПЛИВА. Важно отметить, что из-за отсутствия ориентации требованию, топливо может использоваться для покрытия пространственное разрыв, который существует между BRET и сonventional методы визуализации целого животных.The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить свою благодарность за финансовую поддержку от Пастера фонда Нью-Йорка (в JD, CS, CS), ЕС-FP7 Программа «Автоматизация" (для SLS), Программы Института Карно 11 (в JD, АГ , АР, РТ, SLS) и проекта IMNOS (до комнатной температуры, SLS), Конни-Мейв благотворительный фонд (SLS), европейские мастера в молекулярной визуализации (ИТ), программы Регион Иль-де-Франс MODEXA (SLS), СЕЗАМ (SLS) и DimMalInf (SLS, RT), ANR Программа Grandes Investissement де L'Avenir инфраструктуры Nationales ан Biologie-Santé: Франция LifebioImaging (FLI) Франция Жизнь томография (КТ, SLS), Франция Bioimaging (JD, SLS) и Институт Пастера, Париж. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить, Хосе Bengoechea и Герберт Швейцер для реагентов. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Синди Fevre которые сгенерированный антитела.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |