Utöka grunden och tillämpligheten av fluorescens från Obundet Excitation från Luminescence (FUEL) genom att kartlägga de relevanta principer och demonstrera dess kompatibilitet med en mängd fluoroforer och antikroppsinriktade villkor.
Fluorescens av Unbound Excitation från Luminescence (FUEL) är ett strålnings excitation-emission process som producerar ökad signal och kontrastförbättring in vitro och in vivo. BRÄNSLE delar många av de samma grundprinciper som mareld Resonance Energy Transfer (BRET), men skiljer sig mycket i de acceptabla arbetsavstånd mellan självlysande källan och den fluorescerande enhet. Medan BRET i praktiken begränsas till maximalt 2 gånger Förster radie, vanligen mindre än 14 nm, kan FUEL uppträda på avstånd upp till pm eller ens cm i avsaknad av en optisk absorbator. Här expanderar vi på den grund och tillämpning av BRÄNSLE genom att se över de aktuella principerna bakom fenomenet och visa sin kompatibilitet med ett brett utbud av fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar. Vidare är användbarheten av antikropp-riktad BRÄNSLE utforskas. Exemplen som visas här ger bevis för att FUEL kan utnyttjas för applications där BRET inte är möjligt, fyller den rumsliga tomrum som finns mellan BRET och traditionell hela djuret avbildning.
Den genetisk modifiering av organismer, såsom virus 1, 2, bakterier 3, eller små däggdjur 4 till antingen inducera eller konstitutivt uttryck mareld, har varit mycket framgångsrik och allmänt visade 5-7. Bioluminescence, en in vivo kemiluminiscerande reaktion innefattande naturligt förekommande reagens, har fördelen av att producera ljus utan behov av en extern ljuskälla. Som sådan, inte självlysande avbildning inte lider av de vanliga nackdelarna med auto-och icke-specifik signal finns från fluorescens avbildning 8. Följaktligen har mareld en signifikant signal-till-brus-förhållande eftersom alla detekterade signalen härstammar uteslutande från den avsedda källan. Även om många modeller har utnyttjat lux operonet från Photorhabdus luminescens (emissionsmaximum centrerad mellan 480 och 490 nm) för in vitro-och in vivo-applikationer 9, dess användning i små mammals har varit problematisk på grund av själva karaktären av bildförhållanden; den genomträngande förekomsten av optiska absorptionsmedel, såsom hemoglobin, och spridningsmedel, såsom vävnad och ben, hög grad påverkar blått till gult våglängder 3. Uttrycket av en konstruerad eldfluga luciferas (emissionsmaximum vid 617nm) har nyligen utvecklats och införlivats, ger ett verktyg som kraftigt övervinner optisk absorption 10, men är fortfarande föremål för spridning effekter.
Som svar har det förekommit flera försök till röd-skift den utsända signalen till önskad optiska fönstret på 650-900 nm, en region med minimerad absorption och spridning, med hjälp av bioluminiscens resonansenergiöverföring (BRET) 11-13. Som ett verktyg för att förbättra signaldetektering, BRET, som använder en självlysande källa som givaren och en extra fluorofor som acceptor, har funnit begränsad framgång. Som ett nyskapande exempel på detta fenomen, "självlysande kvantprickar4; (SIQDs) 14 består av modifierad Renilla reniformis luciferaser bundna till externa polymer-lysin lager av kommersiellt tillgänglig kvantprickar (QDs). Vid substrat Dessutom inducerar den resulterande självlysande reaktions fluorescens utsläpp från QDs, genererar en betydande produktion av röda fotoner. Emellertid har dessa SIQDs begränsad tillämpbarhet på in vivo visualisering av fysiologiskt relevanta händelser. Denna begränsade användbarhet beror sannolikt på att det är svårt att koppla den dubbla sond till organ, cell eller genen av intresse, eftersom de SIQDs inte kan genetiskt kodad och därför skulle kräva en sekundär modifiering av polymerskal. För att förbättra deras användbarhet, alternativa SIQDs, där luciferasema är bundna direkt till den självlysande kärnan, har nyligen varit anställd 15. Bygga bort av SIQD konceptet, var en mer tillämplig BRET systemet uppnås genom att fästa Cypridina luciferas till en idocyanine färgämne 16, som var i stånd att specifikt rikta tumörer i möss samtidigt som de producerar en betydande rött skifte från 460 nm till 675 nm. Att genomgå icke-strålande energiöverföring, BRET följer samma primära begränsningar som dess fluorescerande motsvarighet: det måste finnas en stark spektral överlappning mellan utsläpp givaren och acceptor excitationsspektra och arbetsavståndet mellan de två delarna måste vara i storleksordningen av Förster radie (5-14 nm, beroende på givarens-acceptorparet, med en effektiv maximalt avstånd på två gånger Förster radie 17). Detta avstånd beroende begränsar kraftigt de typer av händelser som kan observeras med hjälp av BRET som ett sätt att förbättra upptäckt.
Nyligen kom en ny metod identifierades och visade i både in vitro och in vivo-förhållanden. Att bygga upp grunden för BRET, Fluorescens från Obundet Excitation från Luminescence (FUEL) 18, 19 </sup> kräver också en stark spektral överlappning mellan det luminiscerande och fluorescerande komponenter. Men till skillnad från BRET är FUEL en helt strålnings process där den emitterade fotonen från självlysande källan absorberas av ett optiskt tillgänglig fluorofor, som sedan avger en röd-skiftat fotonen enligt fluoroforen kvantutbytet. Besläktad med BRET, kan också användas för detta tillvägagångssätt för att övervinna de begränsningar av bildbehandling i närvaro av optiska absorbenter. Den resulterande röda förskjutning ger en total ökning och specificitet i den detekterade signalen beroende på en minskning i dämpning och en minskning av optisk spridning effekter. FUEL har rapporterats förekomma mellan självlysande Escherichia coli som uttrycker lux-operon och QDs 18, 19. Medan experimentellt liknar de SIQDs föreligger en väsentlig skillnad: i bränslen, är det inte nödvändigt för det luminiscerande källan att vara fysiskt bunden till fluoroforen, vilket gör att for genetisk kodning av självlysande sonden. På grund av den framgångsrika detektionen av bränsle mellan luminescerande bakterier och QDs, är det möjligt att denna teknik skulle kunna tillämpas på både ytlig (hud) och djup vävnad (lungor, lever) infektioner, såsom Staphylococcus aureus och Klebsiellia pneumoniae.
Sedan rapporten av dess experimentella betydelse har FUEL utvecklats till att omfatta en robust matematisk modell 20 som kan användas för att förutsäga acceptabel självlysande och fluorescerande par, och dess tillämpningar har utökats till att omfatta användning i identifiering av fotofysikaliska egenskaper såsom kvantutbyte. Vi beskriver nedan några av de grundläggande teknikerna för BRÄNSLE. Först visar vi belägg för detta fenomen över både korta (um) och lång (cm) arbetsavstånd, som i grunden skiljer BRÄNSLE från BRET. För det andra, vi utöka de möjliga BRÄNSLE paren genom att undersöka en mängd olika fluoroforer och fluorescerande nanopartiklar. Third, är BRÄNSLE applikationer undersöks genom att jämföra målinriktade och icke-målinriktade BRÄNSLE par.
Den grundläggande demonstration av FUEL kan uppnås genom att helt enkelt blanda självlysande bakterier med fluorescerande nanopartiklar eller kvantprickar. De två enheterna kommer att vara fysiskt separerade och förblir bortom varje effektiv RET avstånd. Svårare är signalen optimering BRÄNSLE både in vitro och in vivo. Under in vitro-förhållanden, både med och utan en optisk absorbator närvarande, vanligtvis tillsats av ett överskott av fluoroforen kommer att vara tillräcklig för att maximera BRÄNSLE svar. Men vid höga koncentrationer företeelser som statisk eller kollisions släckning kan leda till en förlust av fluorescerande signal. Utföra en utspädningsserie genom att oberoende variera koncentrationen av det luminiscenta källan och fluoroforen kommer att hjälpa till att optimera de önskade koncentrationerna. Upprättande och optimering av bränsle under in vivo-koncentrationer är mycket svårare och måste behandlas från fall till fall. Det kan vara svårt att skapa en condition där fluorescerande enhet kan nås optiskt av självlysande källan. Som sådan kan börjar med direkt delprodukter injektioner av de två delarna tillhandahålla information avseende framgången med bränsle under optimala förhållanden.
Standardprotokoll finns för märkning av bakterier och eukaryota celler med fluorescerande enheter såsom serien och QDs Alexa. Ofta innebär ytfunktionalisering eller aktivering med antikroppar, vilket kan leda till oönskade effekter såsom minskad cellviabilitet eller förändrad metabol aktivitet. För att övervinna detta, är det viktigt att bestämma den optimala mängden av antikropp eller aktiveringsmedel behövs som minimerar cellulära störningar samtidigt maximera den fluorescerande märkningen. Användning av kvantprickar är fördelaktigt på grund av deras karakteristiskt bred excitationsspektra, smala och avstämbar emissionsspektra, och möjligheten till ett stort Stokes-skift. Emellertid kan QDs vara cytotoxiskt och får inte vara önskvärt i vissa fall.
<pclass = "jove_content"> FUEL är ett fenomen som förekommer i många Bret experiment 13 och kan tillämpas på en mängd olika självlysande och fluorescerande källor. Hittills har de fotoner som framställs BRÄNSLE behandlade produkten av icke-specifika interaktioner eller en olycklig bakgrundssignal som härrör från dåligt utformade BRET experiment. Det är bara med den typ av experiment visat här att vi kunde identifiera nyttan av denna oönskade signalen. I de exempel som visas, de luminiscerande Bakterierna fungerar som en diffus exciteringskälla med förmåga att framkalla en standard fluorescerande svar från ett stort antal olika fluorescerande enheter. På grund av den stora arbetsavstånd, är det säkert att dra slutsatsen att medan FUEL kan byggas utan att det uppstår BRET i allmänhet BRET kan inte observeras utan ett bidrag från BRÄNSLE. Huvudsakligen på grund av avsaknaden av en måls krav, FUEL kan användas för att täcka den rumsliga gap som finns mellan BRET och conventional hel-djur avbildningstekniker.The authors have nothing to disclose.
Författarna vill rikta sin tacksamhet för ekonomiskt stöd från Pasteur Foundation i New York (till JD, CS, CS), EU-FP7-programmet "Automation" (SLS), Institut Carnot-programmet 11 (till JD, AH , AR, RT, SLS) och projekt IMNOS (till RT, SLS), den Conny-Maeve välgörenhetsstiftelsen (SLS), European Masters i Molecular Imaging (IT), regionen Ile de France program MODEXA (SLS), Sesame (SLS) och DimMalInf (SLS, RT), ANR Program Grandes Investissement de l'avenir infrastrukturer Nation en Biologie-Santé: Frankrike LifebioImaging (FLI) Frankrike Life Imaging (RT, SLS), Frankrike Bioimaging (JD, SLS) och Institut Pasteur, Paris. Vidare vill författarna tacka José Bengoechea och Herbert Schweizer för reagenser. Vidare skulle Författarna tacka Cindy Fevre som genererade antikropparna.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |