扩大荧光通过调查的有关原则和展示与众多的荧光基团和抗体有针对性的条件,其兼容性的基础和适用性由非绑定从激发发光(燃料)。
荧光由未结合的激励从发光(燃料)是产生的增加信号和对比度增强的体外和体内的辐射激发发光的过程。燃料共享许多相同的基本原则,生物发光共振能量转移(BRET),还大大不同于在发光光源和荧光实体之间的可接受的工作距离。而BRET被有效地限制在一个最大的福斯特半径的2倍,通常小于14纳米,燃料可以在没有光吸收发生在距离可达微米或什至厘米。在这里,我们根据燃料的基础和应用拓展通过审查现象背后的有关原则,并展示其与多种荧光基团和荧光纳米颗粒的兼容性。此外,抗体靶向燃料的效用进行了探讨。这里所示的例子中提供的证据表明,燃料可以用于APPLications其中BRET是不可能的,填充空隙空间的那BRET和传统的整体动物成像之间存在。
生物,如病毒1,2,3的细菌,或小哺乳动物的遗传修饰4要么诱导或组成型表达的生物发光,已非常成功并广泛证明5-7。生物发光, 在体内的化学发光反应涉及天然存在的试剂,有而不需要外部光源产生的光的优点。因此,生物发光成像不会从自动和非特异性信号的发现从荧光成像8的共同缺点的。因此,生物发光具有显著信号 – 噪声比,因为任何检测到的信号来源于完全从预期的来源。而许多模型已经利用从发光光的勒克斯操纵子(480和490毫微米之间的中心发射最大值)为在体外和体内应用9,其在小MAMM使用ALS一直是个问题,由于成像条件的性质;光吸收剂,如血红蛋白,和散射剂,如组织和骨的弥漫存在,强烈地影响蓝色到黄色的波长3。一个精心设计的萤火虫荧光素酶(最大发射位于617nm)的表达,最近已经开发并结合,提供了一个工具,极大地克服了光吸收10,但仍受到散射的影响。
作为响应,已经有多种尝试红移发射的信号转换为650-900纳米,最小的吸收和散射的区域所需的光学窗口,用生物发光共振能量转移(BRET)11-13。作为一种工具,以提高信号的检测,BRET,其采用生物发光信号源作为供体和一个附加的荧光团作为受体,目前已发现了有限的成功。作为这种现象的精液例如,“自发光的量子点4; (SIQDs)14包括修改海肾reniformis荧光素酶绑定到外部聚合物-赖氨酸层 市售的量子点(QDs)。后基板此外,所得到的生物发光反应诱导的量子点的荧光发射,产生显著生产的红色光子。然而,这些SIQDs已经在生理有关事件体内可视化有限适用性。这个有限的适用性很可能是由于在双探头连接到器官,细胞或感兴趣的基因,由于SIQDs不能被遗传编码的,因此,就需要在聚合物壳的二次改性的难度。以改善它们的适用性,可替代SIQDs,其中所述荧光素酶直接结合到所述发光芯,最近已采用15。建设关SIQD理念,更适用BRET系统是由连接海萤荧光素酶的实现中docyanine染料16,这是能特异性靶向肿瘤的小鼠同时产生大量的红色转变,从460纳米到675纳米。接受非辐射能量转移,BRET遵循相同的主约束其荧光对应:必须有供体发射和受体的激发光谱和两个基团之间的工作距离之间有很强的光谱重叠必须是顺序福斯特半径(5-14纳米取决于供体-受体对,与福斯特半径17倍的有效的最大距离)。这个距离的依赖性大大限制了可以使用的BRET以提高检测的装置被观察的事件的类型。
最近一种新的方法被确定,并根据表明在体外和体内条件。关栋BRET,通过荧光激发无限制自发光(燃料)18,19的基础</suP>还要求发光和荧光成分之间有很强的光谱重叠。然而,不同于BRET,燃料是一种完全的辐射过程,由此从所述发光光源所发射的光子是由一个光学访问的荧光团,随后根据所述荧光团的量子产率发出红移光子吸收。类似于BRET,这种方法也可以用来克服成像的约束在光吸收剂的存在。所得到的红移提供了在检测到的信号,由于在衰减的降低和减少了光的散射效应的整体增加和特异性。燃料已报道的生物发光大肠杆菌表达勒克斯操纵和量子点18,19之间发生。而实验类似于SIQDs,从根本上存在差异:在燃料,这是没有必要的发光源是物理结合的荧光团,其允许FOr为荧光探针的基因编码。由于成功地检测发光细菌和量子点之间的燃料,它是可能的,这种技术可以同时适用于浅表(皮肤)和深部组织(肺,肝)感染,如金黄色葡萄球菌和肺炎Klebsiellia。
由于它的实验意义的报告,燃料已发展到包括可用于预测可接受的发光和荧光对健壮的数学模型20,其应用领域已扩大到包括用于识别的光物理特性,例如量子效率。我们在下面说明一些燃料的基本技巧。首先,我们展示的证据,这种现象在短期(微米)和长(厘米)的工作距离,这从根本上区别于燃料BRET。第二,我们在可能的燃油对通过检查各种荧光基团和荧光纳米颗粒的扩大。锡尔D,燃料应用通过比较目标和非目标燃料对考察。
燃料的基本演示可以简单地通过混合发光细菌荧光纳米颗粒或量子点来实现。这两个实体将被物理上分开,并保持超出了任何有效的RET距离。更困难的是燃油信号优化在体外和体内 。下在体外条件下,具有和不具有光吸收体存在,通常是加入过量的荧光团将足以最大化燃料反应。然而,在高浓度的现象,如静态或碰撞猝灭可导致荧光信号的损失。由独立改变发光光源和荧光团的浓度进行稀释系列,将有助于优化所需的浓度。在体内的浓度建立和燃料的优化要困难得多,需要在逐案基础上加以解决。它可能很难建立一个共同ndition其中所述荧光实体可以被光学地由发光源访问。因此,与直接合作,注射两个部分的开头可以提供关于燃料的最佳条件下的成功信息。
标准协议标签细菌和真核细胞存在荧光实体,如Alexa的系列和量子点。通常这需要表面功能化或活化的抗体,从而导致像减少细胞存活力的或改变代谢活性的不想要的效果。为了克服这一点,以确定所需要的抗体或活化剂的最佳量是同时最大化的荧光标记细胞的最小扰动是很重要的。利用量子点是因为他们的典型宽的激发光谱,窄,可调发射光谱,和一个大的斯托克斯位移的可能性是有利的。然而,量子点可以是细胞毒性的,可能不希望在某些情况下。
<p级=“jove_content”>燃油是一种现象,它存在于许多BRET实验13,并适用于各种发光和荧光源。到现在为止,从燃料产生的光子被视为非特异性相互作用或设计不当的BRET实验中产生的一个不幸的背景信号的产品。只有用实验证明在这里,我们能够确定这种无用信号的工具类型。在所示的例子中,发光细菌作为漫射声源能够引起从各种各样的荧光实体的标准荧光反应。此外,由于大量的工作距离,它是安全的结论是,虽然燃料可以在不BRET的发生来构成,在一般的BRET不能在没有从燃料中贡献观察。重要的是,由于缺少靶向要求,燃料可以被用于覆盖的空间间隙是BRET和c之间存在onventional全动物成像技术。The authors have nothing to disclose.
作者想(扩大他们的感激之情从纽约巴斯德基金会的资金支持(以法学博士,CS,CS),欧盟第七框架计划“自动化”(以SLS),研究所卡诺计划11至JD,AH ,AR,RT,SLS)和项目IMNOS(至RT,SLS),该的Conny-梅芙慈善基金会(SLS),欧洲大师赛在分子成像(它),该地区法兰西岛计划MODEXA(SLS),芝麻(SLS)和DimMalInf(SLS,RT),该ANR程序GRANDES投资公司DE L'AVENIR基础设施NATIONALES恩Biologie -桑特: 法国LifebioImaging(FLI)法国寿命成像(RT,SLS), 法国生物成像 (法学博士,SLS)和巴斯德研究所,巴黎。此外,作者要感谢,何塞Bengoechea和赫伯特·施韦策的试剂。此外,作者要感谢辛迪热夜谁产生的抗体。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |