Aip1p Dynamics worden gewijzigd door de R256H Mutatie in actine
Summary
Ziekte-veroorzakende mutaties in actine kan cytoskelet functie veranderen. Cytoskelet dynamiek worden gekwantificeerd door beeldvorming van fluorescent gelabelde eiwitten met behulp van totale interne fluorescentie microscopie. Als voorbeeld heeft het cytoskelet eiwit Aip1p, lokalisatie en beweging gewijzigd cellen die de mutant actine isovorm, R256H.
Abstract
Mutaties in actine leiden tot een scala van menselijke ziekten door specifieke moleculaire veranderingen die vaak veranderen cytoskelet functie. In deze studie, weergave van fluorescent gemerkte eiwitten met behulp van totale interne fluorescentie (TIRF) microscopie gebruikt visualiseren en kwantificeren veranderingen in het cytoskelet dynamiek. TIRF microscopie en het gebruik van fluorescente markeringen maakt ook de kwantificering van veranderingen in het cytoskelet dynamica veroorzaakt door mutaties in actine. Met deze techniek kwantificering van cytoskelet functie in levende cellen een waardevolle aanvulling in vitro studies van eiwitfunctie. Als voorbeeld hebben missense mutaties die de actine residu R256 geïdentificeerd in drie humane actine isovormen suggereert dit aminozuur een belangrijke rol speelt regulerende interacties. De effecten van het actine cytoskelet mutatie R256H op bewegingen werden bestudeerd door gistmodel. Het eiwit, Aip1, waarvan bekend is dat cofilin helpen actine depolymerisatie wasgelabeld met groen fluorescerend eiwit (GFP) en de N-terminus en bijgehouden in vivo in TIRF microscopie. De snelheid van Aip1p beweging in beide wild-type en mutante stammen werd gekwantificeerd. In cellen die R256H mutant actine, wordt Aip1p beweging beperkt en de snelheid van de beweging is bijna de helft van de snelheid gemeten in wild-type cellen (0,88 ± 0,30 micrometer / sec in R256H cellen in vergelijking tot 1,60 ± 0,42 micrometer / sec in wild-type cellen, p <0,005).
Introduction
Actine is de dominante eiwit dat het cytoskelet en participeert in kritieke cellulaire processen zoals celdeling, organel beweging, celbeweeglijkheid, krimp, en de signalering. In het afgelopen decennium, hebben ziekteverwekkende mutaties ontdekt actine in elk van de zes menselijke actine isovormen die tot een reeks van aandoeningen, van myopathieën coronaire hartziekte 1-7. De processen waardoor actine mutaties leiden tot ziekte verder worden toegelicht. De gist model blijft de gouden standaard voor de biochemische effecten van mutaties op actine functie vanwege de voordelen van de interne essentiële actine isovorm, genetische traceerbaarheid en hoge behoud van actine sequentie en functie te bestuderen. Studies tonen aan dat individuele actine mutaties leiden tot moleculaire specifieke disfuncties met dominant negatieve effecten 8. Bijvoorbeeld,-doofheid veroorzaken mutaties in γ-niet-spieractine dat de Lys-118 residu beïnvloeden veranderen regulering doorhet actine bindend eiwit Arp2 / 3 9. Studies vaak te gebruiken in vitro analyses van eiwit: eiwit interacties. Onderzoeken naar het effect van actine mutaties celbiologie en met name actine bindend eiwit lokalisatie in de cel beperkt.
Studies van de gist cytoskelet in vivo gewoonlijk afhankelijk beelden van gefixeerde cellen van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop 10. Deze experimenten verstrekte fundamentele gegevens over de morfologie van het actine cytoskelet. Onderzoeken hebben sindsdien opgenomen driedimensionale confocale beeldvorming om de complexe cytoskelet netwerk 11, 12 te visualiseren. Deze beeldvorming maakt kwantificering van de overvloed en de relatieve locatie van actine patches en filamenten. Dunne gedeelte electron tomography is gebruikt om het imago van de morfologie van de dichte draadvormige netwerken ten opzichte van bewaarde subcellulaire structuren 13. Crowded cellulaire spassen met een kleine doorsnede kan tot in detail worden onderzocht met deze techniek. Imaging studies zijn uitgebreid tot levende cellen met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie. Wanneer foto bleken en achtergrond fluorescentie kunnen worden gemodereerd, time lapse imaging laat onderzoeken met betrekking tot de dynamiek van het cytoskelet eiwitten en de reactie op omgevingsfactoren 11, 14. Afzonderlijk visualisatie van de dynamiek van actine filamenten in vitro werd bevorderd door de invoering van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Vergeleken met brede microscopie, TIRF het voordeel van verminderde achtergrondfluorescentie en verbeterd contrast individuele filamenten 15, 16 volgen. Met deze kwaliteiten, is TIRF microscopie is aangepast door celbiologen om cellulaire structuren controleren bij de plasmamembraan 17, 18. Cellulaire gebeurtenissen, waaronder veranderingen in het cytoskelet, kangevisualiseerd worden real time met lage fototoxiciteit, maximale contrast en minimale achtergrond bloei 19.
Om een beter begrip van het effect van actine mutaties op de beweging, lokalisatie en omzet cytoskelet eiwitten in de cel, TIRF microscopie en eiwit tagging gebruikt. Hierin methoden om het effect van een klinisch relevante mutatie in actine cytoskelet van dynamica in Saccharomyces cerevisiae wordt beschreven. Bijzonder de lokalisatie en beweging van het actine bindend eiwit, Aip1p, werd gevisualiseerd en gekwantificeerd in cellen die de R256H mutatie in actine. Deze technieken vullen in vitro biochemische studies en zorgen voor een beter begrip van eiwit interacties en functies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een effectieve strategie om de dynamiek van het cytoskelet en de bruikbaarheid visualiseren onderzoeken op pathogene mutaties is beschreven. Geavanceerde beeldvormende technieken zijn er nieuwe mogelijkheden om de intracellulaire beweging van eiwitten in de buurt van het celmembraan begrijpen gecreëerd. Totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRF) is een gevoelige techniek voor functionele studies in levende cellen. TIRF gebruikt een schuine excitatie laser die een verdwijnende veld door het verschil in br…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Peter Rubenstein voor nuttige discussie en technisch advies en David Pellman voor de originele PB1996 kloon. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de March of Dimes en de financiering van de Ride for the Kids.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O’Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
