Aip1p Dynamics sont modifiés par la R256H Mutation dans actine
Summary
mutations qui causent des maladies dans actine peuvent altérer la fonction du cytosquelette. Dynamique du cytosquelette sont quantifiés grâce à l'imagerie des protéines marquées par fluorescence à l'aide totale microscopie de fluorescence interne. A titre d'exemple, la protéine du cytosquelette, Aip1p, a modifié la localisation et le déplacement dans des cellules exprimant l'isoforme mutante de l'actine, R256H.
Abstract
Des mutations dans actine provoquent une gamme de maladies humaines dues à des changements moléculaires spécifiques qui modifient souvent la fonction du cytosquelette. Dans cette étude, l'imagerie de fluorescence protéines marquées par fluorescence interne totale (FRBR) microscopie est utilisée pour visualiser et quantifier les changements dans la dynamique du cytosquelette. microscopie TIRF et l'utilisation de marqueurs fluorescents permet aussi de quantifier les changements dans la dynamique du cytosquelette causées par des mutations dans l'actine. En utilisant cette technique, la quantification de la fonction du cytosquelette dans les cellules vivantes complète utilement dans des études in vitro de la fonction des protéines. A titre d'exemple, des mutations faux-sens affectent le résidu R256 de l'actine ont été identifiés dans les trois isoformes d'actine humain suggère que cet acide aminé joue un rôle important dans les interactions régulatrices. Les effets de la mutation R256H actine du cytosquelette sur les mouvements ont été étudiés à l'aide du modèle de la levure. La protéine, AIP1, qui est connu pour aider à cofilin dépolymérisation de l'actine, étaitmarqués avec la protéine fluorescente verte (GFP) à l'extrémité N-terminale et suivis in vivo en utilisant la microscopie TIRF. La vitesse de déplacement Aip1p à la fois de type sauvage et des souches mutantes a été quantifiée. Dans les cellules exprimant R256H actine mutant, le mouvement Aip1p est limitée et le taux de circulation est pratiquement la moitié de la vitesse mesurée dans des cellules de type sauvage (0,88 ± 0,30 um / sec dans les cellules R256H par rapport à 1,60 ± 0,42 um / sec dans les cellules de type sauvage, p <0,005).
Introduction
L'actine est la protéine dominante comprenant du cytosquelette et participe au processus cellulaires critiques, y compris la division cellulaire, le mouvement des organites, la motilité cellulaire, la contraction, et la signalisation. Au cours de la dernière décennie, les mutations pathogènes dans actine ont été découvertes dans chacun des six isoformes d'actine humaines menant à une série de troubles, de myopathies de maladie coronarienne 1-7. Les processus par lesquels les mutations conduisent à l'actine maladie continuent à être élucidée. Le modèle de levure reste l'étalon-or pour étudier les effets biochimiques des mutations sur la fonction de l'actine en raison des avantages de la seule isoforme d'actine essentiel, traçabilité génétique et grande conservation de séquence et la fonction de l'actine. Des études montrent que des mutations d'actine individuels conduisent à des dysfonctionnements spécifiques moléculaires avec des effets négatifs dominants 8. Par exemple, les mutations de la surdité causant à l'actine γ-non-musculaires qui affectent le résidu Lys-118 modifie la réglementation parla protéine de liaison de l'actine Arp2 / 3 9. Des études in vitro utilisent fréquemment des analyses des interactions protéine: protéine. Les investigations sur les effets des mutations actine sur la biologie cellulaire et, en particulier, la liaison d'actine localisation de la protéine dans la cellule est limité.
Études du cytosquelette de la levure in vivo reposent classiquement sur des images de cellules fixes à partir d'un microscope inversé à fluorescence 10. Ces expériences ont fourni des données fondamentales sur la morphologie du cytosquelette d'actine. Des enquêtes ont incorporé depuis trois dimensions imagerie confocale pour visualiser le réseau du cytosquelette complexe 11, 12. Cette imagerie permet la quantification de l'abondance et la position relative des patchs d'actine et les filaments. La tomographie d'électrons section mince a été utilisée pour l'image de la morphologie des réseaux filamenteux denses par rapport aux structures sous-cellulaires conservées 13. S cellulaires Crowdedépreuve avec une petite section peuvent être examinées dans les moindres détails avec cette technique. Les études d'imagerie ont été étendues à des cellules vivantes en utilisant laps de temps microscopie fluorescente. Lorsque photo blanchiment et la fluorescence de fond peuvent être modérés, laps de temps imagerie permet enquêtes à la dynamique des protéines du cytosquelette et la réponse aux conditions environnementales 11, 14. Par ailleurs, la visualisation de la dynamique des filaments d'actine in vitro a été avancée par l'introduction du total fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopie. Par rapport à la microscopie à champ large, TIRF présente l'avantage d'une diminution de la fluorescence d'arrière-plan et de contraste amélioré pour surveiller filaments individuels 15, 16. Avec ces qualités, microscopie TIRF a été adaptée par les biologistes cellulaires pour surveiller les structures cellulaires à la membrane plasmique 17, 18. Événements cellulaires, y compris les changements dans le cytosquelette, peutêtre visualisées en temps réel avec une faible phototoxicité, contraste maximal et minimal fond floraison 19.
Pour mieux comprendre l'effet des mutations d'actine sur le mouvement, la localisation et le chiffre d'affaires de protéines du cytosquelette de la cellule, la microscopie TIRF et de protéines de marquage ont été utilisés. Ici, des méthodes pour étudier les effets d'une mutation cliniquement pertinente de l'actine sur la dynamique du cytosquelette dans Saccharomyces cerevisiae sont décrits. Plus précisément, la localisation et le déplacement de la protéine de liaison de l'actine, Aip1p, a été visualisés et quantifiés dans des cellules exprimant la mutation R256H dans actine. Ces techniques se complètent dans les études biochimiques in vitro et permettent une meilleure compréhension des interactions et des fonctions protéiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une stratégie efficace de visualiser la dynamique du cytosquelette et l'utilité dans les enquêtes sur les mutations pathogènes a été décrit ici. Avancées techniques d'imagerie ont créé de nouvelles opportunités pour comprendre le mouvement intracellulaire des protéines près de la membrane cellulaire. Totale microscopie de fluorescence à réflexion interne (FRBR) est une technique sensible pour des études fonctionnelles dans les cellules vivantes. TIRF utilise un laser d'excitation est incliné…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Peter Rubenstein pour des discussions utiles et des conseils techniques et David Pellman pour le clone de PB1996 originale. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Mars of Dimes et le financement de la tour pour les enfants.
Materials
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium Acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
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