Aip1p Dynamics sont modifiés par la R256H Mutation dans actine

Résumé

mutations qui causent des maladies dans actine peuvent altérer la fonction du cytosquelette. Dynamique du cytosquelette sont quantifiés grâce à l'imagerie des protéines marquées par fluorescence à l'aide totale microscopie de fluorescence interne. A titre d'exemple, la protéine du cytosquelette, Aip1p, a modifié la localisation et le déplacement dans des cellules exprimant l'isoforme mutante de l'actine, R256H.

Résumé

Des mutations dans actine provoquent une gamme de maladies humaines dues à des changements moléculaires spécifiques qui modifient souvent la fonction du cytosquelette. Dans cette étude, l'imagerie de fluorescence protéines marquées par fluorescence interne totale (FRBR) microscopie est utilisée pour visualiser et quantifier les changements dans la dynamique du cytosquelette. microscopie TIRF et l'utilisation de marqueurs fluorescents permet aussi de quantifier les changements dans la dynamique du cytosquelette causées par des mutations dans l'actine. En utilisant cette technique, la quantification de la fonction du cytosquelette dans les cellules vivantes complète utilement dans des études in vitro de la fonction des protéines. A titre d'exemple, des mutations faux-sens affectent le résidu R256 de l'actine ont été identifiés dans les trois isoformes d'actine humain suggère que cet acide aminé joue un rôle important dans les interactions régulatrices. Les effets de la mutation R256H actine du cytosquelette sur les mouvements ont été étudiés à l'aide du modèle de la levure. La protéine, AIP1, qui est connu pour aider à cofilin dépolymérisation de l'actine, étaitmarqués avec la protéine fluorescente verte (GFP) à l'extrémité N-terminale et suivis in vivo en utilisant la microscopie TIRF. La vitesse de déplacement Aip1p à la fois de type sauvage et des souches mutantes a été quantifiée. Dans les cellules exprimant R256H actine mutant, le mouvement Aip1p est limitée et le taux de circulation est pratiquement la moitié de la vitesse mesurée dans des cellules de type sauvage (0,88 ± 0,30 um / sec dans les cellules R256H par rapport à 1,60 ± 0,42 um / sec dans les cellules de type sauvage, p <0,005).

Introduction

L'actine est la protéine dominante comprenant du cytosquelette et participe au processus cellulaires critiques, y compris la division cellulaire, le mouvement des organites, la motilité cellulaire, la contraction, et la signalisation. Au cours de la dernière décennie, les mutations pathogènes dans actine ont été découvertes dans chacun des six isoformes d'actine humaines menant à une série de troubles, de myopathies de maladie coronarienne ^1-7. Les processus par lesquels les mutations conduisent à l'actine maladie continuent à être élucidée. Le modèle de levure reste l'étalon-or pour étudier les effets biochimiques des mutations sur la fonc....

Protocole

1. Clonage dans le PB1996 plasmide

1. Conception et de commande des amorces d'ADN à partir d'une société de fabrication d'oligonucléotides qui flanquent la séquence cible et contient des sites de restriction uniques dans le plasmide parent sélectionné. REMARQUE: Dans ce cas, les amorces ont été conçues pour amplifier les 400 paires de bases à l'extrémité 5 'de la séquence AIP1. Le site de restriction XhoI a été incorporé dans l'amorce d'environ 20 pb avant que la séquence AIP1 et Xmal était inclus d'environ 20 pb après la séquence AIP1 cible. Le plasmide utilisé pour le clonage était PB1996, qui contient un mot-clé pour 3XGFP f....

Résultats

Procédé pour imager la dynamique de protéines du cytosquelette de la cellule est présentée. La protéine liant l'actine, Aip1p, a été marqué à la GFP. La conception pour le plasmide codant pour le produit marqué est représenté sur la figure 1. Le plasmide a été ensuite transformé dans des cellules de levure. L'expression de la fluorescence étiquetée Aip1p permis de visualiser le comportement de la protéine dans la cellule. Aip1p localise généralement à des taches d'actine dans les sites d'.......

Discussion

Une stratégie efficace de visualiser la dynamique du cytosquelette et l'utilité dans les enquêtes sur les mutations pathogènes a été décrit ici. Avancées techniques d'imagerie ont créé de nouvelles opportunités pour comprendre le mouvement intracellulaire des protéines près de la membrane cellulaire. Totale microscopie de fluorescence à réflexion interne (FRBR) est une technique sensible pour des études fonctionnelles dans les cellules vivantes. TIRF utilise un laser d'excitation est inclinée et qui crée un .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	rpi	9012-36-6
Bleu de bromophénol	Amresco	115-39-9
BSA	NEB	B9001S
Change-IT Kit de mutagénèse dirigée à sites de mutations multiples	USB Corporation	4166059
CutSmart Buffer	NEB	B7204S
ADN, simple brin à partir de testicules	de saumonSigma	9007-49-2
EDTA pH 7.4	Sigma	93302
Bromure d’éthidium	Invitrogen	15585-011	Avertissement ! Irritation nocive
Kit d’ADN fongique/bactérien	Symo Research	D6005
HpaI	NEB	R0105S
Acétate de lithium	AlfaAesar	6108-17-4
Échelle de faible masse d’ADN	Invitrogen	10068-013
NE Buffer #4	NEB	B7004S
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	Invitrogen	12532-016
Miniprep Kit	Qiagen	27106	N’importe quel kit fonctionnera
Kit de ligature rapide	NEB	M2200S
Azoture de sodium	Sigma	26628-22-8
PBS	Invitrogen	10010-023
PEG	Amresco	25322-68-3
Tris Base Ultrapure	rpi	77-86-1
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	06/01/2015
XhoI	NEB	R0146S
XmaI	NEB	R0180S
YPD media	LabExpress	3011-URA
Media	LabExpress	3010
PCR Machine	Invitrogen	4359659 N’importe	quelle machine PCR fonctionnera
Microscope TIRF	Olympus IX81
Hamamatsu Caméra ORCA-R	Hamamatsu