قياس النفاذية في واحدة Microvessel المعزولة الجرذ إعداد الرئة perfused الدم
Summary
ومعزولة إعداد الرئة perfused الدم يجعل من الممكن تصور شبكات microvessel على سطح الرئة. نحن هنا وصف نهج لقياس نفاذية microvessels واحد في الرئتين معزولة في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير مضان.
Abstract
ويستخدم على نطاق واسع في إعداد معزولة الرئة perfused الدم لتصور وتحديد الإشارات في microvessels واحد. وذلك بربط هذا المستحضر مع التصوير في الوقت الحقيقي، يصبح من الممكن تحديد التغيرات في نفاذية microvessels الرئوي الفردية. هنا نحن تصف الخطوات لعزل الرئتين الفئران ويروي لهم الدم الذاتي. ثم، ونحن الخطوط العريضة خطوات للبث fluorophores أو عن طريق وكلاء microcatheter في منطقة الرئة الصغيرة. باستخدام هذه الإجراءات وصفها، وتحديد الزيادات النفاذية في الفئران الرئة microvessels ردا على دفعات من عديد السكاريد الشحمي البكتيرية. وكشفت البيانات التي زادت عديد السكاريد الشحمي تسرب السوائل عبر كل من وريدي وmicrovessel الشعرية القطاعات. وبالتالي، هذا الأسلوب يجعل من الممكن مقارنة استجابات نفاذية الأوعية الدموية بين شرائح وبالتالي، تحديد أي عدم التجانس في الاستجابة. بينما الأساليب المستخدمة عادة لتحديد نفاذية الرئة تتطلب تحليل نتائج عينات أنسجة الرئة، واستخدام التصوير في الوقت الحقيقي يغني هذا الشرط كما يتضح من الطريقة الحالية. وبالتالي، وإعداد الرئة معزولة جنبا إلى جنب مع التصوير في الوقت الحقيقي يوفر العديد من المزايا أكثر من الطرق التقليدية لتحديد نفاذية الاوعية الدموية الدقيقة في الرئة، ولكن هو وسيلة واضحة لتطوير وتنفيذ.
Introduction
زيادة نفاذية الاوعية الدموية الدقيقة في الرئتين يؤدي إلى تطوير وذمة سنخية وتبادل الغازات وخطر هو سمة رئيسية من إصابة الرئة الحاد (ALI) 1-3. وبالتالي، فإن تقديرات نفاذية الأوعية الدموية مهمة في تحديد مدى إصابة الرئة وفعالية التدخلات العلاجية المقترحة. وتستخدم التحليل الوزني مثل الرئة حرة نسبة الدم الرطب إلى الجاف ومعامل الترشيح الاوعية الدموية الدقيقة على نطاق واسع وسائل لتقدير نفاذية 4،5. وتشمل الأساليب الأخرى قياس الاحتفاظ تحقيقات المشعة أو الفلورية في أنسجة الرئة 6-8. ومع ذلك، فإن الأساليب المذكورة أعلاه تتطلب معالجة postexperiment من عينات أنسجة الرئة نحو توضيح البيانات النفاذية. علاوة على ذلك، منذ حيوان واحد يمكن أن تستخدم إلا لبروتوكول العلاج واحدة، قد تكون هناك حاجة إلى أعداد الحيوانات الكبيرة لدراسة كاملة. والقاسم المشترك بين الطرق أعلاه هو أنهم تحديد نفاذية الأوعية الدموية يعني لجميع الأوعية الدموية في عينة الأنسجة. ومع ذلك، فإنه من الثابت أيضا أن الرئوي سفن الكلي والجزئي تختلف ظاهريا 9. وبالتالي، قد تكون ردود النفاذية غير المتجانسة بين مختلف قطاعات السفينة فضلا 9،10. وبالتالي، قياس نفاذية متوسط جميع الأوعية الرئوية في عينة الأنسجة قد لا تعكس بشكل كاف هذا التجانس.
في عزلة إعداد الرئة perfused الدم، والأوعية الدموية على سطح الرئة يمكن تصور بواسطة المجهر تستقيم 4،11،12. وهذا يتيح تميز الردود في الأوعية واحدة، وبالتالي، ومعالجة أي تباين في ردود 13. بالإضافة إلى ذلك، من خلال الاستفادة من التصوير مضان من microvessels، يمكن إدراجها المقايسات مضان القائم. أبعد من ذلك، وmicrocatheter الأذين الأيسر يمكن استخدامها لتقديم وكلاء وتحقيقات مضان في الأوعية الدموية 11،14. وmicrocatheter يحد من التسليم لمنطقة الرئة الصغيرة، وبالتالي السابقينيطرح فقط في الأوعية الدموية في المنطقة إلى وكلاء غرست وfluorophores. وهذا يسمح مناطق صغيرة متعددة داخل نفس الرئة لاستخدامها في تجارب منفصلة، مما يؤدي إلى انخفاض عام في الحيوانات اللازمة للدراسة.
التصوير في الوقت الحقيقي تمكن من التقاط التغيرات الدينامية في الأوعية الدموية خارج الأوعية ومضان من microvessels واحد من إعداد الرئة معزولة. وبالتالي، لكل microvessel داخل حقل الصورة، يمكن تسجيل التغيرات في مضان خلال ضخ fluorophores وwashoff، وكميا حاليا 14. باستخدام قيم الحد الأقصى والأوعية الدموية المتبقية مضان، يمكن تحديد مؤشر نفاذية لكل microvessel داخل الحقل التصوير. لتحديد التغييرات نفاذية استجابة لعوامل التهابية أو الضارة، وكيل المطلوب يمكن أن تدار أولا ثم تحديد مؤشر النفاذية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعيين حقل صورة في أي مكان داخل منطقة الرئة التي غرست من قبلmicrocatheter، وبالتالي توفير درجة عالية من المرونة في اختيار شبكة الأوعية الدموية المطلوب. وبالتالي، فإن معزولة إعداد الرئة perfused الدم جنبا إلى جنب مع التصوير في الوقت الحقيقي يوفر النموذج التجريبي جذابة لقياس النفاذية في microvessels رئة واحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومعزولة إعداد الرئة perfused الدم إلى جانب التصوير في الوقت الحقيقي يوفر أداة بسيطة لتحديد التغيرات في نفاذية microvessels رئة واحدة. طبقنا هذا الأسلوب لتحديد التغييرات نفاذية ردا على دفعات من LPS. وتشير البيانات المتوفرة لدينا بشكل واضح أن LPS ضخ تسبب زيادة في نفاذية الاوعية ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيدت الدراسات التي NIH HL75503 لKP.
Materials
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure o-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
- Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
- Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
- Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
- Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
- Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
- Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
- Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
- Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
- Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
- Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
- Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).
