Kvantificering Single mikrokardannelse Permeability i Isoleret Blood-perfunderet rottelunge Forberedelse

Summary

Den isolerede lunge forberedelse blod perfunderet gør det muligt at visualisere mikrokar net på lungeoverfladen. Her beskriver vi en metode til at kvantificere permeabilitet af enlige mikrokar i isolerede lunger ved hjælp af real tid fluorescens billeddannelse.

Abstract

Den isolerede lunge forberedelse blod-perfunderet er almindeligt anvendt til at visualisere og definere signalering i enkelt mikrokar. Ved at koble dette præparat med real time scanning, bliver det muligt at bestemme ændringer permeabilitet i de enkelte pulmonale mikrokar. Heri beskrives trin for at isolere rottelunger og perfundere dem med autologt blod. Så vi skitsere skridt til at indgyde fluorophores eller agenter via en microcatheter ind i en lille lunge region. Ved hjælp af disse procedurer, der er beskrevet, vi bestemt permeabiliteten vokser i rottelunge mikrokar reaktion på infusioner af bakteriel lipopolysaccharid. De data viste, at lipopolysaccharid øget lækage på tværs af både venular og kapillær mikrokardannelse segmenter. Således er denne metode gør det muligt at sammenligne svarene permeabilitet blandt vaskulære segmenter og dermed definere nogen heterogenitet i svaret. Mens almindeligt anvendte metoder til at definere lunge permeabilitet kræver efterbehandle af lungevæv prøver, denanvendelse af tidstro billeddannelse overflødiggør dette krav som det fremgår af den foreliggende fremgangsmåde. Således isolerede forberedelse lunge kombineret med real time scanning giver flere fordele i forhold til traditionelle metoder til at bestemme lunge mikrovaskulære permeabilitet, men alligevel er en enkel metode til at udvikle og implementere.

Introduction

Øget mikrovaskulære permeabilitet i lungerne fører til udvikling af alveolær ødem og kompromitteret gasudveksling og er en stor karakteristisk for akut lungeskade (ALI) ^1-3. Overslag over vaskulær permeabilitet er vigtige ved fastlæggelse af omfanget af lungeskader og effekt af de foreslåede terapeutiske indgreb. Gravimetrisk analyse såsom blod gratis lunge våd-til-tørre-forhold og mikrovaskulære filtrering koefficient er almindeligt anvendte metoder til at estimere permeabilitet ^4,5. Andre metoder omfatter kvantificering af tilbageholdelse af radioaktivt eller fluorescerende prober i lungevæv ^6-8. Men de ovennævnte metoder kræver postexperiment behandling af lunge vævsprøver mod belyse data permeabilitet. Eftersom et dyr kan kun anvendes til en enkelt behandling protokol, kan der være behov for en fuldstændig undersøgelse stort antal dyr. En fælles egenskab ved de ovennævnte fremgangsmåder er, at de bestemmer middelværdien vaskulær permeabilitet foralle blodkar i vævsprøven. Det er imidlertid velkendt, at pulmonale mikro-og makro-skibe er fænotypisk forskellige ^9. Derfor kan svarene permeabilitet være heterogen blandt de forskellige skibstyper såvel ^9,10. Således kvantificerer gennemsnitlige gennemtrængelighed af alle pulmonale fartøjer i en vævsprøve, kan ikke i tilstrækkelig grad afspejler denne heterogenitet.

I den isolerede lunge forberedelse blod perfunderet kan blodkar på lungeoverfladen visualiseres ved en opretstående mikroskop ^4,11,12. Dette gør det muligt kendetegner reaktioner i enkelte skibe, og dermed løse eventuelle heterogenitet i svarene ^13. Desuden ved at udnytte fluorescensimagografi af mikrokar fluorescens assays kan inkorporeres. Endvidere kan en venstre atrial mikrokateter anvendes til at levere midler og fluorescens prober i blodkar ^11,14. Mikrokateteret begrænser levering til en lille lunge regionen og således exkun at frembyde blodkarrene i regionen til de infused agenter og fluorophores. Dette tillader flere små områder inden for samme lunge skal bruges til separate eksperimenter, hvilket fører til en samlet reduktion i dyr, der er nødvendige for en undersøgelse.

Real time scanning muliggør opsamling af dynamiske ændringer i vaskulær og ekstravaskulære fluorescens af enlige mikrokar af de isolerede forberedelse lunge. For hvert mikrokar i et billede felt, kan registreres ændringer i fluorescens under infusion af fluoroforer og afvaskningsstation og kvantificeret offline ^14. Brug værdierne for det maksimalt og resterende vaskulær fluorescens, kan et indeks gennemtrængelighed for hver mikrokardannelse i Billedfeltet bestemmes. For at bestemme ændringer permeabilitet som reaktion på inflammation eller skadelige stoffer, kan den ønskede middel administreres først, og derefter indeksere permeabilitet bestemt. Desuden kan billedfeltet sættes overalt i lungen region infunderesmicrocatheter, således at en høj grad af fleksibilitet i valg af den ønskede vaskulære netværk. Således isolerede forberedelse lunge blod-perfunderet i tandem med realtid billedbehandling giver en attraktiv eksperimentel model til at kvantificere permeabilitet i enkelt lunge mikrokar.

Protocol

Alle eksperimenter udført på dyr var som godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Tennessee Health Science Center. 1.. Tubing for perfusing rottelunge Forberedelser Forbered et rørsystem med Tygon slanger (# 18) til blodperfusion som vist i figur 1.. Slut tryktransducere (P23XL) og placere slangen på mikroskopet scenen. Indstil vandbadstemperatur på 37 ° C. Forbind lunge ind-og udtag midlertidigt med Tygon slange…

Representative Results

En isoleret lunge forberedelse blod perfunderet tilsluttet perfusionsslange og beslægtet udstyr er vist i fig. 2. Til demonstrationsformål, vi anvendte en Sprague Dawley rotte, selvom fremgangsmåderne beskrevet heri, kan anvendes med enhver rottearten. Infusioner gennem en venstre forkammer mikrokateter nå kun et lille område af lungen. Det infunderede region kan identificeres ved infusion-induceret misfarvning (figur 3). Fremstillingen lungen som positioneret for real-time imaging…

Discussion

Den isolerede lunge forberedelse blod-perfunderet kombineret med realtids billedbehandling giver et simpelt værktøj til bestemmelse af ændringer permeabilitet i enkelt lunge mikrokar. Vi anvendte denne fremgangsmåde til at definere ændringer permeabilitet som reaktion på infusion af LPS. Vores data tyder klart på, at LPS infusion forårsagede en stigning i den mikrovaskulære permeabilitet. Yderligere data viser også, at ændringer i permeabilitet induceret af LPS var ens i begge vener og kapillærer. Således e…

Materials

Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole  and a handle  to secure o-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4