Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding
Summary
De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.
Abstract
De geïsoleerde bloed geperfundeerd long preparaat wordt veel gebruikt visualiseren en definiëren signalering in enige microvaatjes. Door de koppeling van deze voorbereiding met real-time beeldvorming, wordt het mogelijk om de permeabiliteit in de individuele pulmonale bloedvaten te bepalen. Hierin beschrijven we stappen rattenlongen isoleren en perfuseren ze met autoloog bloed. Vervolgens schetsen we stappen om fluoroforen of agenten via een microkatheter bezielen in een kleine long regio. Met behulp van deze procedures beschreven, bepaalden wij permeabiliteit toename rattenlong microvaatjes in reactie op infusies van bacteriële lipopolysaccharide. De gegevens bleek dat lipopolysacharide toegenomen lek in zowel venular en capillaire microvessel segmenten. Dus deze methode is het mogelijk om de permeabiliteit antwoorden vergelijken tussen vasculaire segmenten en daarmee vast elke heterogeniteit in de respons. Terwijl gebruikelijke methoden longpermeabiliteit definiëren nabewerking vereisen longweefsel monsters, degebruik van real-time beeldvorming ondervangt deze eis zoals blijkt uit de huidige werkwijze. Zo is de gïsoleerde voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele methoden om long microvasculaire permeabiliteit te bepalen, maar is een eenvoudige methode te ontwikkelen en te implementeren.
Introduction
Verhoogde microvasculaire permeabiliteit in de longen leidt tot ontwikkeling van alveolair oedeem evenals gemanipuleerde gasuitwisseling en is een belangrijk kenmerk van acute longbeschadiging (ALI) 1-3. De ramingen van vasculaire permeabiliteit zijn belangrijk bij het bepalen van de omvang van longbeschadiging en effectiviteit van voorgestelde therapeutische interventies. Gravimetrische analyse zoals bloed vrij long nat-naar-droog-verhouding en microvasculaire filtratie coëfficiënt worden veel gebruikte methoden voor het schatten permeabiliteit 4,5. Andere werkwijzen omvatten het kwantificeren het behoud van radioactieve of fluorescente probes in longweefsel 6-8. De bovenstaande methoden vereisen postexperiment verwerking longweefsel monsters naar het ophelderen van de permeabiliteit gegevens. Aangezien een dier alleen kan worden gebruikt voor een behandelingsprotocol, kunnen grote aantallen dieren vereist voor volledige studie. Een gemeenschappelijk kenmerk van de bovengenoemde werkwijzen is dat zij bepalen de gemiddelde vasculaire permeabiliteit vooralle bloedvaten in het weefselmonster. Het is echter bekend dat long micro-en macro-vaartuigen fenotypisch verschillend 9. Daarom kan permeabiliteit responsen heterogeen tussen de verschillende vlootsegmenten ook 9,10. Zo kwantificeren gemiddelde permeabiliteit van alle longvaten in een weefselmonster kan onvoldoende rekening met deze heterogeniteit.
In de geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding, kan de bloedvaten op de long oppervlak worden gevisualiseerd door een rechtopstaande microscoop 4,11,12. Hierdoor kunnen karakteriseren reacties in enkele schepen en dus de afhandeling van heterogeniteit in de antwoorden 13. Bovendien, door gebruik van fluorescentie beeldvorming van microvaatjes, fluorescentie gebaseerde testen kunnen worden opgenomen. Verder kan een linker atrium microkatheter worden om middelen en fluorescentie probes leveren in bloedvaten 11,14. De microcatheter beperkt de levering aan een kleine long regio, aldus exposeren alleen de bloedvaten in de regio om de toegediende agenten en fluoroforen. Hierdoor kunnen meerdere kleine gebieden binnen dezelfde longen te worden gebruikt voor afzonderlijke experimenten, wat leidde tot een vermindering dieren nodig voor een studie.
Real time beeldvorming maakt vangst van dynamische veranderingen in vasculaire en extravasculaire fluorescentie van enkele microvessels van de gïsoleerde voorbereiding. Zo moet in elk microvaatje in een afbeeldingsveld, veranderingen in fluorescentie gedurende infusie van fluoroforen en washoff kan worden geregistreerd en gekwantificeerd offline 14. Met behulp van de waarden van de maximale en de resterende vasculaire fluorescentie, kan een permeabiliteit index voor elke microvaatje binnen het beeldveld worden bepaald. Om doorlaatbaarheid verandert in reactie op ontstekingen of schadelijke stoffen te bepalen, kan de gewenste middel eerst worden toegediend en dan bepaald de permeabiliteit index. Bovendien kan het beeldveld overal ingesteld worden longzone toegediend als demicrokatheter, waardoor een hoge mate van flexibiliteit in de gewenste vasculaire netwerk. Zo is de geïsoleerde bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een aantrekkelijk experimenteel model om de permeabiliteit te kwantificeren in enkele long haarvaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een eenvoudig hulpmiddel voor het bepalen van de permeabiliteit veranderingen in enkele long haarvaten. Wij pasten deze methode doorlaatbaarheid verandert in reactie op infusies van LPS te bepalen. Onze gegevens suggereren duidelijk dat LPS infusie veroorzaakt een toename van de microvasculaire permeabiliteit. Verder, de gegevens blijkt ook dat permeabiliteit veranderingen geïnduceerd door LPS waren vergelijkbaar in beide …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studies werden ondersteund door NIH HL75503 aan KP.
Materials
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure o-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
- Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
- Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
- Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
- Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
- Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
- Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
- Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
- Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
- Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
- Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
- Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).
