Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung
Summary
Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat macht es möglich, Mikrogefäßnetzwerken auf der Lungenoberfläche zu visualisieren. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Durchlässigkeit der einzelnen Mikrogefäße in isolierten Lungen quantifizieren mit Echtzeit-Fluoreszenz-Bildgebung.
Abstract
Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat ist weit verbreitet, zu visualisieren und zu definieren Signalisierung in einzelnen Mikrogefäßen. Durch Kopplung dieser Zubereitung mit Echtzeit-Bildgebung, wird es möglich, Veränderungen der Durchlässigkeit der einzelnen Lungenmikrogefäßen zu bestimmen. Hier beschreiben wir Schritte, um Rattenlungen isolieren und durchströmen sie mit Eigenblut. Dann skizzieren wir Schritte, um Fluorophore oder Agenten über einen Mikrokatheter in eine kleine Lungenbereich ziehen lassen. Mit diesen beschriebenen Verfahren haben wir festgestellt Lässigkeit erhöht in Rattenlunge Mikrogefäße als Reaktion auf Infusionen von bakteriellen Lipopolysaccharide. Die Daten zeigten, dass Lipopolysaccharid erhöhte Flüssigkeitsleck über beide venulären und Kapillar-Mikrogefäßsegmente. Somit macht es dieses Verfahren möglich, die Durchlässigkeit Reaktionen unter Gefäßsegmente zu vergleichen und definieren keine Heterogenität in der Antwort. Während häufigsten verwendeten Methoden, um Lungendurchlässigkeit definieren erfordern Nachbearbeitung von Lungengewebeproben, dieVerwendung von Echtzeit-Bildgebung entfällt diese Anforderung aus dem vorliegenden Verfahren als deutlich. So bietet die isolierte Lungenpräparat kombiniert mit Echtzeit-Bildgebung mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden der Lungenmikrovaskuläre Permeabilität zu bestimmen, noch ist eine einfache Methode zu entwickeln und umzusetzen.
Introduction
Erhöhte mikrovaskuläre Permeabilität in der Lunge führt zu einer Entwicklung der alveolären Ödem und beeinträchtigt den Gasaustausch und ist ein wesentliches Merkmal des akuten Lungenversagens (ALI) 03.01. Somit sind die Schätzungen der vaskulären Permeabilität bei der Festlegung des Umfangs der Lungenschädigung und die Wirksamkeit der vorgeschlagenen therapeutischen Maßnahmen wichtig. Gravimetrische Analyse wie Blut kostenlos Lungen nass-Trocken-Verhältnis und mikrovaskulären Filtrationskoeffizient sind weit verbreitete Methoden, die Durchlässigkeit 4,5 schätzen. Andere Methoden umfassen die Quantifizierung der Retention von radioaktiven oder fluoreszierenden Sonden im Lungengewebe 6-8. Allerdings sind die obigen Verfahren erfordern postexperiment Verarbeitung von Lungengewebeproben zu der Aufklärung der Permeabilität Daten. Darüber hinaus, da ein Tier nur für einen einzigen Behandlungsprotokoll verwendet werden, große Tierzahlen kann für eine vollständige Untersuchung erforderlich sein. Ein gemeinsames Merkmal der oben genannten Verfahren ist, dass sie die mittlere Gefäßdurchlässigkeit fürAlle Blutgefäße innerhalb der Gewebeprobe. Es ist jedoch bekannt, dass Lungen Mikro-und Makrogefäße phänotypisch unterschiedlichen 9. Daher kann Lässigkeit heterogene Reaktionen zwischen den verschiedenen Gefäßsegmente als auch 9,10 sein. So Quantifizierung mittlere Durchlässigkeit aller Lungengefäße in einer Gewebeprobe kann nicht angemessen widerspiegelt diese Heterogenität.
In der isolierten durchbluteten Lungen Vorbereitung können Blutgefäße auf der Lungenoberfläche von einem aufrechten Mikroskop 4,11,12 visualisiert werden. Dies ermöglicht die Charakterisierung Antworten in Einzelgefäße und damit, Adressierung keine Heterogenität in den Antworten 13. Zusätzlich kann durch die Verwendung von Fluoreszenz-Bildgebungsmikrogefäße können fluoreszenzbasierten Assays eingebaut werden. Ferner kann eine linke Herzmikrokatheter verwendet werden, um Agenten und Fluoreszenzsonden in Blutgefäße 11,14 liefern werden. Der Mikrokatheter begrenzt die Lieferung an einen kleinen Lungenbereich, also abposiert nur die Blutgefäße in der Region zu den infundiert Mittel und Fluorophore. Dadurch können mehrere kleine Regionen innerhalb der Lunge zu verschiedenen Experimenten verwendet werden, was zu einer Gesamtverringerung der Tiere für eine Untersuchung erforderlich ist.
Echtzeit-Bildgebung ermöglicht eine Erfassung der dynamischen Veränderungen im vaskulären und extravaskulären Fluoreszenz der einzelnen Mikrogefäße des isolierten Lungenpräparat. Somit wird für jede Mikrogefäß innerhalb eines Bildfeldes, Änderungen der Fluoreszenz während der Infusion von Fluorophoren und Auswaschen aufgezeichnet werden können, und quantifiziert offline 14. Mit Werten der maximalen und Restgefäß Fluoreszenz kann eine Durchlässigkeit Index für jedes Mikrogefäß im Imaging-Bereich bestimmt werden. Änderungen der Permeabilität als Reaktion auf schädliche oder entzündliche Agenzien zu bestimmen, können die gewünschten Mittel zuerst verabreicht werden und dann wird der Durchlässigkeitsindex bestimmt. Darüber hinaus kann das Bildfeld überall in der Lunge durch die Region infundiert eingestellt werdenMikrokatheter, wodurch eine hohe Flexibilität in der Auswahl der gewünschten Gefäßnetz. Somit ist die isolierten Blutdurchbluteten Lungenpräparat im Tandem mit Echtzeit-Bildgebung bietet eine attraktive experimentellen Modell die Durchlässigkeit in einzelnen Mikrogefäßen der Lunge zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat in Verbindung mit Echtzeit-Bildgebung liefert ein einfaches Tool zur Bestimmung der Durchlässigkeit Veränderungen in einzelnen Mikrogefäßen der Lunge. Diese Methode wurde die Durchlässigkeit sich in Reaktion auf Infusionen von LPS zu definieren. Unsere Daten legen nahe, dass deutlich LPS-Infusion verursacht einen Anstieg der mikrovaskulären Durchlässigkeit. Ferner können die Daten auch, dass Veränderungen der Durchlässigkeit durch LPS induzierten waren in beiden Ven…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studien wurden durch die NIH HL75503 KP unterstützt.
Materials
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure o-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
- Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
- Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
- Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
- Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
- Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
- Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
- Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
- Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
- Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
- Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
- Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).
