Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

Summary

La preparazione isolato polmone sangue perfuso rende possibile visualizzare le reti microvasali sulla superficie polmonare. Qui si descrive un metodo per quantificare permeabilità delle singole microvasi nei polmoni isolati utilizzando l'imaging di fluorescenza in tempo reale.

Abstract

La preparazione isolato polmone sangue perfuso è ampiamente usato per visualizzare e definire segnalazione in singoli microvasi. Accoppiando questa preparazione con la rappresentazione in tempo reale, diventa fattibile per determinare le variazioni di permeabilità delle singole microvasi polmonari. Qui descriviamo passi per isolare i polmoni di ratto e profumato con sangue autologo. Poi, abbiamo delineare misure per infondere fluorofori o agenti attraverso un microcatetere in una piccola regione del polmone. Utilizzando queste procedure descritte, abbiamo determinato un aumento della permeabilità nel ratto microvasi polmonari in risposta alle infusioni di lipopolisaccaride batterico. I dati hanno rivelato che lipopolisaccaride aumentata perdita di liquido in entrambi i segmenti venulare e capillare dei microvasi. Così, questo metodo permette di confrontare le risposte permeabilità tra segmenti vascolari e quindi, definisce alcun eterogeneità nella risposta. Mentre i metodi comunemente usati per definire la permeabilità polmonare richiedono post-elaborazione di campioni di tessuto polmonare, iluso di imaging in tempo reale evita questo requisito come evidente dal presente metodo. Così, la preparazione polmone isolato combinato con l'imaging in tempo reale offre diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali per determinare la permeabilità microvascolare polmonare, ma è un metodo semplice per sviluppare e implementare.

Introduction

Aumento della permeabilità microvascolare nei polmoni porta allo sviluppo di edema alveolare e gli scambi gassosi compromessa ed è un importante caratteristica del danno polmonare acuto (ALI) ^1-3. Pertanto, le stime di permeabilità vascolare sono importanti nel definire l'entità del danno polmonare e l'efficacia degli interventi terapeutici proposti. Analisi gravimetrica come rapporto polmone gratuito sangue wet-to-dry e coefficiente di filtrazione microvascolare sono ampiamente utilizzati metodi per stimare la permeabilità ^4,5. Altri metodi includono quantificare la ritenzione di sonde radioattive o fluorescenti nel tessuto polmonare ^6-8. Tuttavia, i metodi di cui sopra richiedono un'elaborazione postexperiment di campioni di tessuto polmonare verso chiarire i dati di permeabilità. Inoltre, poiché un animale può essere utilizzato solo per un protocollo singolo trattamento, possono essere necessari grandi numeri di animali per uno studio completo. Una caratteristica comune dei metodi sopra descritti è che essi determinano la permeabilità vascolare medio pertutti i vasi sanguigni all'interno del campione di tessuto. Tuttavia, è noto che polmonari micro-e macro-vasi sono fenotipicamente diversi ^9. Quindi, risposte permeabilità possono essere eterogenei tra i vari segmenti di flotta e ^9,10. Così, quantificando la permeabilità media di tutti i vasi polmonari in un campione di tessuto può non riflettere adeguatamente tale eterogeneità.

Nella preparazione isolato polmone sangue perfuso, vasi sanguigni sulla superficie polmonare possono essere visualizzati tramite un microscopio verticale ^4,11,12. In questo modo le risposte che caratterizzano in singoli vasi e, quindi, affrontare qualsiasi eterogeneità nelle risposte ^13. Inoltre, utilizzando imaging di fluorescenza di microvasi, saggi di fluorescenza base possono essere incorporati. Inoltre, un microcatetere atriale sinistro può essere utilizzato per fornire agenti e sonde di fluorescenza nei vasi sanguigni ^11,14. Microcatetere limita la consegna di una piccola regione polmonare, così exche propone solo i vasi sanguigni all'interno della regione agli agenti infusi e fluorofori. Questo consente a più piccole regioni dello stesso polmone da utilizzare per esperimenti separati, portando ad una riduzione complessiva animali necessari per uno studio.

L'imaging in tempo reale consente l'acquisizione dei cambiamenti dinamici nella vascolare e fluorescenza extravascolare singoli microvasi della preparazione polmone isolato. Così, per ogni microvasi all'interno di un campo immagine, cambiamenti nella fluorescenza durante l'infusione di fluorofori e washoff possono essere registrati, e quantificati in linea ^14. Utilizzando i valori di fluorescenza massima e residua vascolare, un indice di permeabilità per ogni microvasi nel campo dell'imaging può essere determinato. Per determinare le variazioni di permeabilità in risposta ad agenti infiammatori o pregiudizievoli, l'agente desiderato può essere somministrato prima e poi l'indice di permeabilità determinato. Inoltre, il campo dell'immagine può essere regolato dovunque nella regione polmonare infusa dallomicrocatetere, consentendo così un elevato grado di flessibilità nella scelta della rete vascolare desiderato. Così, l'isolato di sangue perfuso preparazione del polmone in tandem con le immagini in tempo reale fornisce un modello sperimentale interessante per quantificare permeabilità dei microvasi polmonari singoli.

Protocol

Tutti gli esperimenti condotti su animali erano come approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Tennessee Health Science Center. 1. Tubing preparati perfusione Rat Lung Preparare un sistema di tubi con tubi Tygon (# 18) per la perfusione di sangue come mostrato in Figura 1. Collegare trasduttori di pressione (P23XL) e posizionare il tubo sul palco microscopio. Regolare la temperatura del bagno d'acqua a 37 ° C….

Representative Results

Un isolato preparazione polmone sangue perfuso collegato al tubo per perfusione e relative apparecchiature è mostrato in Figura 2. A scopo dimostrativo, abbiamo usato un ratto Sprague Dawley, se le procedure qui descritte possono essere utilizzati con qualsiasi specie di ratto. Infusioni attraverso un microcatetere atriale sinistra raggiungono solo una piccola regione del polmone. La regione infuso può essere identificato dal scolorimento infusione indotta (Figura 3). La preparazione …

Discussion

La preparazione isolato polmone sangue perfuso accoppiato con immagini in tempo reale fornisce un semplice strumento per la determinazione delle variazioni di permeabilità in microvasi polmonari singoli. Abbiamo applicato questo metodo per definire cambiamenti di permeabilità in risposta alle infusioni di LPS. I nostri dati indicano chiaramente che LPS infusione provocato un aumento della permeabilità microvascolare. Inoltre, i dati indicano anche che i cambiamenti di permeabilità indotte da LPS erano simili in entr…

Materials

Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Need quantity 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21G
Peristaltic pump	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 tubing	Becton Dickinson	427421	30 cm needed
PE-10 tubing	Becton Dickinson	427401	40 cm needed
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Custom made with a 20 mm diamter hole  and a handle  to secure o-ring to holder
Upright fluorescence microscope	Olympus America	BX61WI
Image Acquisition Software	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4