単離された血液灌流ラットの肺の準備にシングル微小血管透過性を定量化する
Summary
孤立した血液灌流肺準備が肺表面上の微小血管ネットワークを可視化することが実現可能になります。ここでは、リアルタイムの蛍光画像を用いて単離された肺における単一微小血管の透過性を定量化するためのアプローチを記載する。
Abstract
単離された血液灌流肺製剤が広く可視化し、単一の微小血管内シグナリングを定義するために使用される。リアルタイムイメージングにより、この調製物を結合することによって、個々の肺微小血管透過性における変化を決定することが可能となる。ここに我々は、ラットの肺を隔離し、自己血でそれらを灌流する手順について説明します。その後、我々は小さな肺領域にマイクロカテーテルを経由してフルオロフォアまたは薬剤を注入するための手順の概要を説明します。記載され、これらの手順を使用して、我々は、細菌のリポ多糖の注入を受けてラット肺微小血管内の透過性の増加を決定した。データは、リポ多糖の両方細静脈や毛細血管の微小血管セグメントにわたって流体の漏れを増加させたことを明らかにした。したがって、この方法は、血管透過性のセグメント間の応答を比較することが可能となり、従って、応答内の任意の不均一性を規定する。肺の透過性を定義するために一般的に使用される方法は、肺組織サンプルの後処理を必要としながら、リアルタイムイメージングの使用は、本方法から明らかなように、この要件を回避する。このように、リアルタイムで画像化と組み合わせた孤立性肺準備が肺微小血管透過性を決定するために、従来の方法に比べていくつかの利点を提供しています、まだ開発し、実装するための簡単な方法です。
Introduction
肺における微小血管透過性の増加は、浮腫および肺胞の妥協ガス交換の開発につながり、急性肺損傷（ALI）1-3の主要な特徴である。従って、血管透過性の推定値は、肺損傷および提案された治療的介入の有効性の範囲を定義する上で重要である。このような血中遊離肺のウェット対ドライ比と微小血管ろ過係数として重量分析は、広く浸透性4,5を推定するための方法を使用します。他の方法は、肺組織中の6-8放射性または蛍光プローブの保持を定量することが挙げられる。しかしながら、上記の方法は、透過性データを解明に向けて肺組織サンプルのpostexperiment処理を必要とする。一匹の動物は、単一の治療プロトコルに使用することができるので、大型動物番号は完全な研究のために必要とされ得る。上記の方法の共通の特徴は、彼らが平均血管透過性を決定するということです組織サンプル内の全ての血管。しかし、周知の肺ミクロおよびマクロ血管が表現型的に異なっている9ことが確立されている。このため、透過性の応答は、同様に9,10の様々な血管セグメントの中で異質かもしれません。このように、組織サンプル中のすべての肺血管の平均透過性を定量化することは十分にこの不均一性を反映しない場合があります。
単離された血液灌流肺製剤において、肺表面上の血管が正立顕微鏡4,11,12によって可視化することができる。これは、単一の容器内の応答を特徴づけるため、応答13内の任意の不均一性に対処することができます。また、微小血管の蛍光イメージングを利用して、蛍光ベースのアッセイは、組み込むことができる。また、左心房のマイクロカテーテルは、血管11,14内剤および蛍光プローブを送達するために使用することができる。マイクロカテーテルは、小さな肺領域への配信を制限し、このようにEX注入された薬剤と蛍光団にリージョン内でのみ血管を装った。これは、同じ肺内の複数の小領域は、研究に必要な動物の全体的な減少をもたらす、別々の実験のために使用することができる。
リアルタイムイメージングは、孤立した肺の準備の単一微小血管の血管および血管外蛍光の動的な変更の取得を可能にします。したがって、画像フィールド内の各微小血管のために、フルオロフォアおよびウォッシュオフの注入の間蛍光の変化を記録し、オフライン14を定量することができる。最大残留血管の蛍光値を用いて、撮像視野内の各微小血管の透過性指数を決定することができる。炎症性または有害な薬剤に応じて、透過性の変化を決定するために、所望の薬剤を最初に投与することができ、その後の透過性指数を決定した。また、画像フィールドには、注入によって肺の領域内のどこにでも設定することができるマイクロカテーテル、所望の血管網を選択する際の高度な柔軟性を可能にする。このように、リアルタイムで画像化と並行して孤立した血液灌流肺の準備は、単一の肺の微小血管内の透過性を定量化するための魅力的な実験モデルを提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
リアルタイムイメージングと相まって孤立血液潅流肺標本は、単一の肺の微小血管内の透過性の変化を測定するためのシンプルなツールを提供しています。我々は、LPSの注入に応じて透過性の変化を定義するには、この方法を適用した。我々のデータは明らかに、LPS注入は、微小血管透過性の増加を引き起こしたことを示唆している。また、データも、LPSによって誘導された透過性の変化は?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、KPにNIH HL75503によってサポートされていました。
Materials
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
| Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
| Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21G |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
| PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure o-ring to holder | ||
| Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
| Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
| Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).
- Parthasarathi, K., et al. Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries. J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).
- Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury. Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).
- Gorin, A. B., Stewart, P. A. Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).
- Boutoille, D., et al. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Stevens, T. Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells. Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).
- Ofori-Acquah, S. F., et al. Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions. Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).
- Kandasamy, K., et al. Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels. Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).
- Kandasamy, K., et al. Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels. PloS One. 8, (2013).
- Qiao, R. L., Bhattacharya, J. Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed. J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).
- Parthasarathi, K. Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).
- Wu, Y., Perlman, C. E. In situ methods for assessing alveolar mechanics. J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).
- Kuebler, W. M., et al. A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung. Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).
