Выделенный крови перфузии подготовка легких делает возможным визуализировать микрососудов сетей на поверхности легких. Здесь мы опишем подход к количественной проницаемость отдельных микрососудов в изолированных легких использованием изображений в режиме реального времени флуоресценции.
Выделенный крови перфузии подготовка легких широко используется для визуализации и определения сигналов в одиночных микрососудов. Объединяя этот препарат с изображениями в режиме реального времени, становится возможным определить изменения проницаемости в отдельных легочных микрососудов. Здесь мы опишем шаги, чтобы изолировать легких крыс и заливать их с аутологичной крови. Тогда, мы наметим шаги, чтобы вселить флуорофоры или агентов через микрокатетера в небольшой области легких. Используя эти методики, описанные, мы определили повышение проницаемости микрососудов в легких крыс в ответ на вливаний бактериального липополисахарида. Данные показали, что липополисахарид увеличился утечки жидкости через обе венулярный и капиллярная микрососудов сегментов. Таким образом, этот метод позволяет сравнить ответы проницаемости среди сосудистых сегментов и, таким образом, определить любое гетерогенность в ответе. В то время как часто используемые методы, чтобы определить проницаемость легких требуют постобработки образцов легочной ткани,Использование визуализации в реальном времени это требование исключает Как видно из настоящего способа. Таким образом, изолированные подготовка легких в сочетании с изображениями в реальном времени имеет ряд преимуществ перед традиционными методами для определения легких микрососудов проницаемость, но это простой способ для разработки и реализации.
Увеличение микрососудов проницаемость в легких приводит к развитию альвеолярного отека и скомпрометированной газообмена и является основной характеристикой острого повреждения легких (ALI) 1-3. Таким образом, оценки проницаемости сосудов играют важную роль в определении степени повреждения легких и эффективности предложенных терапевтических вмешательств. Гравиметрического анализа, таких как кровяное бесплатно легких мокрого на сухой отношение и коэффициента фильтрации микрососудов широко используются методы для оценки проницаемости 4,5. Другие способы включают количественное определение удержание радиоактивных или флуоресцентных зондов в легочной ткани 6-8. Однако, эти методы требуют postexperiment обработку образцов легочной ткани на выяснение данных проницаемости. Кроме того, поскольку одно животное может быть использован только для одного протокола лечения, большое количество животных могут быть необходимы для полного исследования. Общей характеристикой описанных выше способов является то, что они определяют среднюю сосудистую проницаемость длявсе кровеносные сосуды внутри образца ткани. Тем не менее, хорошо известно, что легочные микро-и макро-сосуды фенотипически отличается 9. Таким образом, ответы проницаемости может быть гетерогенным среди различных сегментов сосудов, а 9,10. Таким образом, количественного среднее проницаемость всех легочных сосудов в образце ткани не могут адекватно отражать эту неоднородность.
В изолированной перфузии кровью подготовки легких, кровеносных сосудов на поверхности легких могут быть визуализированы с помощью вертикального микроскопа, 4,11,12. Это позволяет, характеризующие ответы в одиночных судов и, таким образом, решения любых гетерогенность в ответах 13. Кроме того, с использованием флуоресцентной визуализации микрососудов, флуоресцентные анализы на основе могут быть включены. Кроме того, левого предсердия Микрокатетер могут быть использованы для доставки агентов и флуоресценции зондов в кровеносные сосуды 11,14. Микрокатетер ограничивает доставку в небольшой области легких, таким образом, экссоздает только кровеносные сосуды внутри региона к инфузии агентов и флуорофорами. Это позволяет использовать несколько небольших регионов в рамках одной легких, которые будут использоваться для отдельных экспериментов, что привело к общему снижению животных, необходимых для исследования.
Изображений в режиме реального времени позволяет захват динамических изменений в сосудистой и внесосудистой флуоресценции одиночных микрососудов изолированной подготовки легких. Таким образом, для каждого микрососудов в пределах области изображения, изменения флуоресценции во время инфузии флуорофоров и washoff могут быть записаны, и количественно в автономном режиме 14. Использование значений максимальной и остаточной флуоресценцией сосудов, индекс проницаемости для каждого микрососудов в области формирования изображения может быть определена. Для определения изменения проницаемости в ответ на воспалительные или вредных веществ, требуемый агент может быть введен, а затем индекс проницаемости определен. Кроме того, поле изображения может быть установлен в любом месте в пределах области легких учитывающеймикрокатетер, таким образом обеспечивая высокую степень гибкости в выборе нужную сеть сосудов. Таким образом, изолированные крови перфузии подготовка легких в тандеме с изображениями в реальном времени обеспечивает привлекательный экспериментальную модель для количественной проницаемость в единичных микрососудов легких.
Выделенный крови перфузии подготовка легких в сочетании с изображениями в режиме реального времени предоставляет простой инструмент для определения изменений проницаемости в отдельных микрососудов легких. Мы применили этот метод для определения изменения проницаемости в ответ на ?…
The authors have nothing to disclose.
Исследования были поддержаны NIH HL75503 в КП.
Tygon Tubing | Fisher Scientific | #18 | |
Pressure Transducer | Data Sciences International | P23XL | Need quantity 3 |
Butterfly Needle | Greiner Bio-One | 450081 | 21G |
Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
PE-90 tubing | Becton Dickinson | 427421 | 30 cm needed |
PE-10 tubing | Becton Dickinson | 427401 | 40 cm needed |
Syringe Pump | Braintree Scientific | BS8000 | |
O-ring | Custom made with a 20 mm diamter hole and a handle to secure o-ring to holder | ||
Upright fluorescence microscope | Olympus America | BX61WI | |
Image Acquisition Software | Molecular Devices | Metamorph | |
FITC Dextran 20KD | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values) | |
Lipopolysaccharide | Sigma Aldrich | Serotype 0111:B4 |