Vi præsenterer en enkel og effektiv protokol til generering af humane makrofager. Buffy coats behandles af dobbelt densitetsgradientcentrifugering og isolerede monocytter derefter differentieres til makrofager i teflonbelagte cellekultur poser. Dette maksimerer makrofag udbytter og letter cellehøst til efterfølgende eksperimenter.
Humane makrofager er involveret i et væld af patologiske processer lige fra infektionssygdomme til kræft. Således udgør de et værdifuldt værktøj til at forstå de underliggende mekanismer i disse sygdomme. Vi har derfor præsentere en enkel protokol til isolering af humane monocytter fra buffy coats, efterfulgt af en differentiering procedure, som resulterer i høje makrofag udbytter. Teknikken meste afhængig almindeligt tilgængelige laboratorieudstyr og dermed giver en pris og tid effektiv måde at opnå store mængder af humane makrofager. Kort fortalt buffy coats fra raske bloddonorer underkastet en dobbelt densitetsgradientcentrifugering at høste monocytter fra perifert blod. Disse monocytter dyrkes derefter i fluorerede ethylenpropylen (FEP) Teflon-belagt cellekultur poser i nærvær af makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF). De opdelte makrofager let kan høstes og anvendes til efterfølgende undersøgelser og funktionellesiger. Vigtige metoder til kvalitetskontrol og validering af isolering og differentiering skridt vil blive fremhævet i protokollen. Sammenfattende protokollen beskrevet her giver forskerne rutinemæssigt og reproducerbart isolere humane makrofager uden behov for omkostningseffektive intensiv værktøj. Endvidere kan sygdomsmodeller studeres i et syngen menneskelige system omgår anvendelsen af murine makrofager.
Celler fra monocytlinjen og deres terminalt differentierede derivater – makrofager – udviser en slående plasticitet i forhold til deres biologiske funktion, der fører til deres deltagelse i så forskellige processer som udvikling, væv reparation, og immunitet 1. Sidstnævnte skyldes deres fagocytiske og antigen-præsenterende evne som placerer makrofager på skillevejen mellem immunrespons medfødte og adaptive 2. Men deres evne udskille cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer og andre signalmolekyler 1 ikke blot øger deres immun-modulerende funktion, men tjener også som grundlag for deres ekstra funktioner. Forsøg på at afspejle disse forskellige aktivering trin i forbindelse med ikke-mikrobielle medierede forhold har resulteret i kategorierne M1 og M2 3. Mens denne klassificering ikke er fuldstændig, giver det mulighed for en grundlæggende forståelse af makrofag biologi.
På grund af disse mangeartede funktioner det kommer ikke som nogen overraskelse, at makrofager er forbundet med mange forhold, der på en eller anden måde involverer vævsombygning eller betændelse. Ved siden af deres grundlæggende rolle i anerkendelse og clearance af invaderende patogener 4-6, er makrofager i stigende grad kommet i fokus i åreforkalkning, fibrose, fedme og kræft 7-10. En reproducerbar metode til frembringelse af humane makrofager er derfor afgørende for en forståelse af disse patologier. Her præsenterer vi en metode baseret på isolering af humane monocytter fra perifert blod fra raske donorer ved en dobbelt densitetsgradientcentrifugering teknik som beskrevet tidligere 11. For at lette differentiering i retning af makrofager, er de isolerede monocytiske celler inkuberet i nærvær af lave koncentrationer af M-CSF og normalt humant serum 12. For at lette yderligere håndtering og cellehøst er differentiering udført i gaspermeabel FEPTeflonbelagte cellekultur poser med en hydrofob overflade 12-15. De resulterende hvilende makrofager kan blive udsat for en bred vifte af assays, som de er stadig i stand til at reagere i enten en M1 eller M2-lignende måde. Alternative metoder til monocyt isolation og efterfølgende differentiering såsom magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) eller modstrøm centrifugal elutriering (CCE) har nogle begrænsninger med hensyn til udbytte, omkostninger og tid, der kræves. Den heri beskrevne protokol giver den fordel, at det kan udføres med standard laboratorieudstyr uden behov for særlige reagenser (f.eks MLA magnetiske perler) eller udstyr (f.eks apparater CCE) og giver mulighed for behandling af store mængder af celler.
Makrofager er vigtige effektorceller i det medfødte immunsystem og vise vigtige funktioner i immunmodulation, antigenpræsentation og vævshomeostase. På grund af deres bemærkelsesværdige plasticitet, de er i stand til at reagere på forskellige stimuli med ændringer i deres fænotype. Dog er hidtil en masse data om makrofag polarisering opnået i det murine systemet, selvom der er rapporter, der viser, at kun omkring 50% af makrofag polarisering markører kan direkte oversættes fra mus til menneske 16. Derfor præsenterer vi her en metode til at opnå primære humane makrofager i tilstrækkeligt antal og renhed uden behov for dyre materialer, f.eks MACS magnetiske perler eller en modstrøms centrifugal elutriation enhed.
Vores fremgangsmåde er baseret på isolering af monocytter fra PBMC'er og deres efterfølgende differentiering til makrofager i FEP teflonbelagt cellekultur poser i nærvær af lave koncentrations af M-CSF 11-13. Mens monocytter udgør mindre end 5 til 10% af perifere blod leukocytter hos mennesker, ved stimulering de ansættes til perifere steder, hvor de differentierer til hjemmehørende vævsmakrofager eller dendritiske celler 17. Cytokinet M-CSF er vigtig for monocyt overlevelse og driver deres differentiering til makrofager 18,19. Hidtil har de M-CSF koncentrationer, som blev udvalgt til monocyt differentiering lå op til 100 ng / ml, men i vores protokol vi er i stand til at opnå et tilstrækkeligt antal modne makrofager med en M-CSF koncentration på kun 2,5 ng / ml 12 20. Desuden dyrkes cellerne i FEP teflonbeklædte cellekultur poser, der letter frigørelse af makrofager og deres efterfølgende såning i definerede celleantal. Da poserne kan genbruges flere gange, dette yderligere nedsætter omkostningerne til isolering proces.
De makrofager opnået ved denne fremgangsmådeer yderst positivt for CD45, CD14, CD11, CD11 c og vise udtryk for mannosereceptoren CD206 som argumenterer for en population af rene, modne makrofager 21,22. Især høj CD14 udtryk er typisk for makrofager differentierede under tilstedeværelse af M-CSF 23. Efter udsåning af cellerne, de udviser en hurtig tilslutning til plastoverflader med nogle celler, der viser en typisk spindel-lignende morfologi, mens andre udviser et spejlæg fænotype. Dette er i overensstemmelse med observationer fra andre forfattere 18,22,24.
Det blev rapporteret, at monocyt differentiering i nærværelse af M-CSF fører til M2-polariserede makrofager 16,25. Imidlertid makrofager isoleret ved vores protokol er stadig i stand til at reagere på en lang række stimuli, herunder udsættelse for tumorceller afledt mikrovesikler og co-kultur med tumorceller 26,27 eller udsættelse for LPS, som de reagerer med induktion af pro- inflammatoriske gener, såsom IL-1 &# 946 ;, TNFa Wnt5a eller forskellige matrixmetalloproteinaser, der betragtes som typiske for M1-polariserede makrofager 3,5,28.
Konklusionen er, at isolation af monocytter efter dobbelt densitetsgradient centrifugering og efterfølgende differentiering i retning af makrofager i FEP teflonbeklædte cellekultur poser resulterer i høje antal makrofager uden behov for teknisk vanskelige eller dyre procedurer. De opnåede makrofager kan anvendes til efterfølgende analyse spænder fra klassisk aktivering via LPS til co-kultur med tumorceller.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke fru Meike Schaffrinski for hendes altid fremragende teknisk bistand i løbet af de sidste par år.
Dette arbejde blev finansieret gennem Forskningsrådet tysk (DFG) i den fælles forskning gruppe 942 (FOR942) og forskningsprogrammet for Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Georg-August-Universität Göttingen.
antibodies for immunophenotyping | Beckman Coulter | for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795) | |
BioLegends | for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105) | ||
Axiovert 200M microscope | Zeiss | ||
calcein-AM | AnaSpec | 89201 | |
combi-stopper closing cones | Braun | 4495101 | |
1x PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS |
10x PBS, w/o Ca and Mg | Invitrogen | 14200-067 | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1084211000 | prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter |
cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based) | Gibco | 13151-014 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated |
Ficoll (density 1.077g/ml) | Biochrom AG | L6115 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
goat anti-mouse FITC | santa cruz | sc-2010 | |
LPS from E.coli | Sigma | L8274 | final conc: 100 ng/ml |
Multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
Penicillin/streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
Percoll (density 1,131g/ml) | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
Perfusor syringe 50ml | Braun | 8728844F | |
Phalloidin-TRITC | Sigma | P1951 | resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml) |
Plastic Disposable Pasteur Pipettes | LVL technologies | 2655181 | |
rh M-CSF | ImmunoTools | 11343117 | Resuspend in 500µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot |
RPMI-1640 with Phenol Red | Gibco | 21875-034 | |
RPMI-1640 without Phenol Red | Gibco | 11835-063 | |
sterilization paper | VP group | 3KFKFS230116 | |
Trypan Blue stain (0,4% w/v) | Sigma | T8154 | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, small | CellGenix | 72-C | |
FEP Teflon-coated cell culture bag, large | CellGenix | 197-C |