Aiguë traumatisme cérébral chez la souris Suivi par longitudinale à deux photons imagerie
Summary
Traumatisme cérébral aigu est une blessure grave qui n'a pas de traitement adéquat à ce jour. La microscopie multiphotonique permet d'étudier longitudinalement le processus de développement du cerveau de traumatisme aigu et stratégies thérapeutiques sondage chez les rongeurs. Deux modèles de traumatisme cérébral aigu étudié avec in vivo à deux photons imagerie cérébrale sont démontrées dans ce protocole.
Abstract
Bien traumatisme cérébral aigu entraîne souvent des dommages de tête dans différentes accidents et affecte une fraction importante de la population, il n'existe aucun traitement efficace pour le moment. Limites de modèles animaux actuellement utilisés empêchent la compréhension du mécanisme de la pathologie. La microscopie multiphotonique permet d'étudier les cellules et les tissus dans le cerveau des animaux intacts longitudinalement dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous décrivons deux modèles de lésion cérébrale aiguë étudiés au moyen de l'imagerie à deux photons du comportement des cellules du cerveau dans des conditions post-traumatiques. Une région du cerveau est lésé choisi avec une aiguille pour produire un traumatisme, d'une largeur et une profondeur contrôlée dans le parenchyme cérébral. Notre procédé utilise stéréotaxique piqûre avec une aiguille de seringue, qui peut être combinée avec l'application simultanée de médicaments. Nous proposons que cette méthode peut être utilisée comme un outil de pointe pour étudier les mécanismes cellulaires de conséquences physiopathologiques de traumatisme aigu dans le cerveau des mammifères <em> In vivo. Dans cette vidéo, nous combinons une lésion cérébrale aiguë avec deux préparations: crânienne fenêtre et crâne éclaircie. Nous discutons également des avantages et des limites des deux préparations pour l'imagerie multisession de régénération du cerveau après un traumatisme.
Introduction
Lésion cérébrale aiguë est un problème important de santé publique avec une incidence élevée de blessures dans des accidents de véhicules à moteur, les chutes ou les agressions, et la forte prévalence de l'incapacité chronique ultérieure. Approches thérapeutiques pour le traitement des lésions du cerveau restent totalement symptomatique, limitant ainsi l'efficacité des soins préhospitaliers, chirurgicale et critique. Cela rend l'impact social et économique de la lésion cérébrale particulièrement sévère. Pour une variété de raisons, la plupart des essais cliniques n'ont pas réussi à démontrer l'amélioration de la récupération après une lésion cérébrale à l'aide de nouvelles approches thérapeutiques.
Les modèles animaux sont cruciales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques vers un stade où l'efficacité du médicament peut être prédite chez les patients avec des lésions cérébrales. À l'heure actuelle, plusieurs modèles animaux bien établies de traumatisme crânien existent, y compris l'impact contrôlé corticale 1, percussion fluide blessure 2, déformation dynamique corticale 3, à chute de poids4, et 5 photo blessures. Un certain nombre de modèles expérimentaux ont été utilisés pour étudier certains aspects morphologiques, moléculaires et comportementaux de traumatisme crânien-pathologie associée. Toutefois, aucun modèle animal unique est tout à fait réussi à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques. Développement de modèles animaux fiables, reproductibles et contrôlées de lésion cérébrale est nécessaire d'évaluer les processus pathologiques complexes.
La nouvelle combinaison des dernières technologies d'imagerie microscopique et journalistes fluorescentes codées génétiquement offre une occasion sans précédent d'étudier toutes les phases de la lésion cérébrale, qui comprennent des blessures primaire, la propagation de la lésion primaire, secondaire blessures et la régénération. En particulier, in vivo microscopie à deux photons est une technique optique non linéaire unique qui permet la visualisation en temps réel des structures cellulaires et sous-cellulaires, même dans les couches corticales profondes du cerveau de rongeurs. Plusieurs types de cellules et des organelles peuvent être visualisés simultanément en combinant différents marqueurs fluorescents. Grâce à cet outil puissant, nous pouvons visualiser les changements morphologiques et fonctionnels dynamiques cerveau vivant dans des conditions post-traumatiques. Les avantages de in vivo microscopie à deux photons dans l'étude des lésions cérébrales ont été récemment démontré par Kirov et ses collègues 6. L'utilisation d'un modèle de convergence de contusion corticale doux, ces auteurs ont montré que la blessure aiguë dendritique dans le cortex pericontusional est déclenché par la baisse du débit sanguin local. En outre, ils ont démontré que le cortex métaboliquement compromis autour du site de contusion est en outre endommagé par la dépolarisation d'étalement. Ce dommage secondaire affecte circuit synaptique, rendant les conséquences de la lésion cérébrale traumatique plus sévère.
Ici, nous proposons la méthode de piqûre stéréotaxique avec une aiguille de seringue, qui peut être combinée avec l'application du médicament topique simultanée, en tant que modèle avancée de cerveau localeblessure et comme un outil pour étudier les conséquences physiopathologiques de traumatisme aigu dans le cerveau des mammifères in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
traumatisme du cerveau est, un événement imprévisible brusque. Ici, nous décrivons le modèle animal qui reproduit un spectre de changements pathologiques observés chez des patients humains après une lésion cérébrale telle que la neurodégénérescence, l'élimination des dendrites, un oedème cérébral, une cicatrice gliale, des hémorragies dans le cortex cérébral associé à une hémorragie sous-arachnoïdienne focal et une perméabilité accrue de l' barrière hémato-encéphalique. Pour étudier…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes profondément reconnaissants au Dr Frank Kirchhoff pour fournir GFAP-EGFP et souches de souris CX3CR1-EGFP. Le travail a été soutenu par des subventions du Centre de mobilité internationale de la Finlande, Tekes, finlandais Graduate School of Neuroscience (FGSN) et l'Académie de Finlande.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
