siRNA Screening at identificere Ubiquitin og ubiquitinlignende System Regulators Biologisk Pathways i dyrkede pattedyrceller
Summary
Her beskriver vi en metode til at udføre en målrettet siRNA "ubiquitome" skærmen for at identificere nye ubiquitin og ubiquitin-lignende regulatorer af HIF1A-medierede cellulære respons på hypoxi. Dette kan tilpasses enhver biologisk sti, hvor en robust læse ud af reporter aktivitet er tilgængelige.
Abstract
Post-translationel modifikation af proteiner med ubiquitin og ubiquitin-lignende molekyler (UBLs) fremstår som en dynamisk cellulær signalering netværk, der regulerer forskellige biologiske veje, herunder hypoxi reaktion proteostasis, DNA beskadigelse respons og transkription. For bedre at forstå hvordan UBLs regulere veje relevante for sygdom hos mennesker, har vi samlet en menneskelig siRNA "ubiquitome" bibliotek bestående af 1.186 siRNA duplex puljer rettet mod alle kendte og forventede komponenter af UBL systemets veje. Dette bibliotek kan screenes mod en række cellelinjer, der udtrykker reportere af forskellige biologiske veje til at bestemme, hvilke UBL komponenter virker som positive eller negative regulatorer af vejen pågældende. Her beskriver vi en protokol udnytter dette bibliotek at identificere ubiquitome-regulatorer af HIF1A cellulær respons på hypoxi ved anvendelse af en transkription-baseret luciferase reporter. En indledende analyse udviklingsfaseer udført for at etablere passende screening parametre af den cellelinje, før du udfører skærmen i tre faser: primær, sekundær og tertiær / deconvolution screening. Brugen af målrettet i hele genomet siRNA bibliotekerne bliver mere og mere populært, da det giver den fordel for rapportering kun medlemmer af vejen, som efterforskerne er mest interesseret. Trods iboende begrænsninger af siRNA screening, falsk-positive især forårsaget af siRNA ikke-tilsigtede effekter, identifikation af ægte nye regulatorer af veje pågældende opveje disse mangler, som kan overvindes ved at udføre en række omhyggeligt gennemført kontrol eksperimenter.
Introduction
Ændring af proteiner med ubiquitin og ubiquitin-lignende molekyler (UBLs) repræsenterer en ekspansiv biokemisk system, der regulerer forskellige biologiske veje og stressreaktioner. Den kovalente binding af UBLs til deres mål-proteiner kan have forskellige resultater regulerer stabilitet, lokalisering, funktion eller interactome af substratet 1. De enzymatiske trin underliggende UBL modifikation blev først etableret for ubiquitin, og nu tjener som et paradigme for modifikation med de fleste UBLs, herunder SUMO, NEDD8, ISG15 og FAT10. For ændring optræder, carboxylatgruppen af UBL diglycine motiv første aktiveres af en E1-aktiverende enzym til dannelse af en høj-energi thiol, der overføres til det aktive sted cystein af et E2-konjugerende enzym. E2 derefter interagerer med et substrat-bundne E3 ligase at mægle overførsel af UBL på (normalt) et mål lysin rest skabe en forgrenet kæde (isopeptide) kobling 2. Successive runder af modifikation kan forekomme at opbygge isopeptide kæder på substratet, som for ubiquitin kan ske via en af dens syv lysiner eller gennem dets N-terminale methionin til at skabe lineære ubiquitin kæder. Disse ændringer danner diskrete topologier med forskellige formål, såsom at skabe nye interaktion motiver og målretning proteiner til nedbrydning forud for UBL fjernelse af specialiserede proteaser. I tilfælde af ubiquitin er der to E1 enzymer, 30-40 E2 konjugerende enzymer, mindst 600 E3 ligaser og ca 100 deubiquitylating enzymer (DUBs). Mens veje er mindre ekspansiv for de andre 10 eller deromkring UBLs den samlede ubiquitome kompleksitet giver enorm mangfoldighed i den biologiske resultat af en bestemt UBL modifikation. Men mens store fremskridt i UBL biologi er blevet gjort, de præcise cellulære roller de fleste af disse ubiquitome komponenter forbliver ukendt.
Brugen af korte interfering ribonukleinsyre (siRNAs) har vist sig som et stærkt værktøj i reverse genetik på grund af den evne siRNAs at målrette cellulære mRNA'er til destruktion, så den rolle de enkelte gener, der skal undersøges i forskellige biologiske 3 sammenhænge. Hele genomet skærme er blevet brugt til at identificere og validere nye regulatorer af mange cellulære processer, og har skabt et væld af nyttige data tilgængelige for den bredere videnskabelige samfund. Men mens hele genomet skærme har vist sig særdeles nyttig, er målrettet skærme bliver mere og mere populære, da de er billigere, hurtigere, indebærer mindre data management og kun rapportere om medlemmer af genomet, hvori den forsøgsansvarlige er mest interesseret. Derfor bedre at forstå hvilke cellulære processer UBL familien komponenter er involveret i, har vi samlet en menneskelig siRNA bibliotek rettet mod alle kendte og forventede komponenter i ubiquitome. Dette omfatter UBLs, E1 aktiverende enzymer, E2 konjugerendeenzymer, E3-ligaser, ubiquitin-bindende domæne (UBD)-holdige proteiner og DUBs. Dette bibliotek kan anvendes til screening af en lang række reporter cellelinjer af forskellige biologiske problemer, således at det objektiv identifikation af hidtil ukendte UBL komponenter for disse veje.
Følgende protokol beskriver, hvordan man udfører en streng målrettet siRNA ubiquitome skærmen for at identificere nye regulatorer af HIF1A-afhængige respons på hypoxi. Under normal oxygenspændingen, HIF1A er underlagt prolyl hydroxylering, der får den til at blive anerkendt og målrettet for nedbrydningen af Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase kompleks 4. Hypoxia hæmmer prolyl hydroxylering fører til stabilisering af HIF1A og den efterfølgende binding til hypoxi respons elementer (hRes) til at drive genekspression. Her beskriver vi en skærm ved hjælp U20S osteosarkomceller stabilt udtrykker ildflueluciferase under kontrol af tre tandemkopier af Hypoxia Respons Element (U20S-HRE celler) 5.. Denne protokol kan tilpasses til enhver biologisk vej, hvis en robust udlæsning af reporter aktivitet er opnåeligt, og kan kobles med relevante positive og negative kontroller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brugen af genom-dækkende siRNA skærme i pattedyrceller har vist sig at være yderst værdifuldt at identificere nye regulatorer af forskellige biologiske veje. Her har vi beskrevet anvendelsen af en målrettet ubiquitome siRNA skærmen for at identificere regulatorer af HIF1A cellulær respons på hypoxi. Målrettede skærme bliver mere og mere attraktive som de generelt er billigere, hurtigere, nemmere at administrere og aflægger kun rapport om de pathway komponenter, som efterforskerne er interesseret <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) og den skotske institut for cellesignalering (nu en del af MRC proteinphosphorylering og ubiquitylering enhed).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
