Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo
Summary
Aquí se describe una metodología para llevar a cabo un siRNA dirigidos pantalla "ubiquitome" para identificar nuevos ubiquitina y reguladores-ubiquitina de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia. Esto puede ser adaptado a cualquier vía biológica, donde una lectura robusta de la actividad del indicador está disponible.
Abstract
Modificación posterior a la traducción de las proteínas con ubiquitina y ubiquitina-como las moléculas (Ubls) se está convirtiendo en una red de señalización celular dinámica que regula diversos procesos biológicos, incluyendo la respuesta a la hipoxia, proteostasis, la respuesta al daño del ADN y la transcripción. Para entender mejor cómo UBLs regulan las vías pertinentes a la enfermedad humana, hemos recopilado un siRNA humana "ubiquitome" biblioteca que consta de 1.186 piscinas siRNA dúplex dirigidos todos conocidos y predijo componentes de las vías del sistema de UBL. Esta biblioteca se puede criba frente a una gama de líneas celulares que expresan los reporteros de diversas vías biológicas para determinar qué componentes UBL actúan como reguladores positivos o negativos de la vía en cuestión. Aquí se describe un protocolo que utiliza esta biblioteca para identificar ubiquitome-reguladores de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia mediante un indicador de luciferasa basado en la transcripción. Una etapa inicial de desarrollo de ensayosse lleva a cabo para establecer los parámetros de detección adecuados de la línea celular antes de realizar la pantalla en tres etapas: detección / deconvolución primaria, secundaria y terciaria. El uso de objeto a través de siRNA bibliotecas de todo el genoma se está convirtiendo cada vez más popular, ya que ofrece la ventaja de la cobertura del sólo miembros de la vía con la que los investigadores están más interesados. A pesar de las limitaciones inherentes de la detección siRNA, en particular, los falsos positivos causados por siRNA fuera de objetivo efectos, la identificación de auténticos nuevos reguladores de las vías en cuestión superan estas deficiencias, que pueden ser superadas mediante la realización de una serie de experimentos de control llevadas a cabo cuidadosamente.
Introduction
La modificación de proteínas con ubiquitina y ubiquitina-como las moléculas (Ubls) representa un sistema bioquímico expansiva que regula diversos procesos biológicos y las respuestas al estrés. La unión covalente de UBLs a sus proteínas diana puede tener diversos resultados que regulan la estabilidad, la localización, función o interactoma del sustrato 1. Los pasos enzimáticos subyacentes UBL modificación se establecieron por primera vez para la ubiquitina, y ahora sirven como paradigma para la modificación con la mayoría de UBLs, incluyendo SUMO, NEDD8, ISG15 y FAT10. Para que se produzca la modificación, el grupo carboxilato del motivo diglicina UBL se activa por primera vez por una enzima de activación E1 para formar un tiol de alta energía que se transfiere a la cisteína del sitio activo de una enzima de conjugación E2. El E2 entonces interactúa con un E3 ligase sustrato determinado para mediar la transferencia de la LBM en (generalmente) un residuo de lisina objetivo la creación de una cadena ramificada (isopeptídico) vinculación 2. Las rondas sucesivas de modificación pueden ocurrir para construir cadenas isopeptídicos sobre el sustrato, que para la ubiquitina puede ocurrir a través de cualquiera de sus siete lisinas, o a través de su metionina N-terminal para crear cadenas de ubiquitina lineales. Estas modificaciones forman topologías discretas con diversos fines, tales como la creación de nuevos motivos de interacción y dirigir proteínas para la degradación antes de la remoción UBL por proteasas especializados. En el caso de la ubiquitina hay dos enzimas E1, E2 30-40 enzimas de conjugación, al menos 600 ligasas E3 y aproximadamente 100 enzimas deubiquitylating (DUBS). Mientras que las vías son menos expansiva para las otras 10 o así UBLs, la complejidad general ubiquitome ofrece gran diversidad en el resultado biológico de una modificación particular UBL. Sin embargo, mientras que los principales avances de la biología UBL se han hecho, las funciones celulares precisas de la mayoría de estos componentes ubiquitome siguen siendo desconocidos.
El uso de short interfering ácido ribonucleico (siRNAs) ha emergido como una herramienta poderosa en la genética inversa, debido a la capacidad de los siRNAs para dirigirse específicamente a los ARNm celulares para la destrucción, permitiendo que el papel de los genes individuales que se examinó en diferentes contextos biológicos 3. Pantallas de todo el genoma se han utilizado para identificar y validar nuevos reguladores de muchos procesos celulares, y han creado una gran cantidad de datos útiles al alcance de la comunidad científica en general. Sin embargo, mientras que las pantallas de todo el genoma han demostrado ser extremadamente útil, pantallas específicas son cada vez más populares, ya que son más baratos, más rápidos implican menos la gestión de datos y un informe sólo sobre los miembros del genoma en el que el investigador está más interesado. Por lo tanto, para entender mejor los componentes de la familia los procesos celulares UBL están involucrados en, hemos recopilado una biblioteca humana siRNA dirigido todos los conocidos y predijo componentes del ubiquitome. Esto incluye los UBLs, la activación de enzimas E1, E2 conjugaciónenzimas, ligasas E3, dominio de unión a ubiquitina (UBD) que contienen proteínas y DUBs. Esta biblioteca se puede utilizar para la pantalla contra una amplia gama de líneas celulares indicadoras de problemas biológicos distintos, permitiendo así la identificación imparcial de componentes UBL novedosos que rigen estas vías.
El siguiente protocolo describe cómo realizar una rigurosa siRNA dirigidos ubiquitome pantalla para identificar nuevos reguladores de la respuesta HIF1A dependiente a la hipoxia. Bajo la tensión de oxígeno normal, HIF1A está sujeta a hidroxilación prolilo que hace que sea reconocida y destinada a la degradación por el Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase complejo 4. La hipoxia inhibe la hidroxilación prolil que conduce a la estabilización de HIF1A y su posterior unión a elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) para conducir la expresión de genes. Aquí, se describe una pantalla utilizando células de osteosarcoma U20S de forma estable que expresa luciferasa de luciérnaga bajo el control de tres copias en tándem de la Hypoxia Elemento de Respuesta (células U20S-HRE) 5. Este protocolo se puede adaptar para cualquier vía biológica si un robusto lectura de salida de la actividad del indicador es alcanzable y se puede acoplar con controles positivos y negativos apropiados.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de pantallas de siRNA en todo el genoma de células de mamíferos se ha demostrado ser de gran valor en la identificación de nuevos reguladores de las vías biológicas distintas. Aquí, hemos descrito el uso de una pantalla de ARNsi ubiquitome dirigido a identificar reguladores de la respuesta celular mediada por HIF1A a la hipoxia. Pantallas dirigidas están volviendo cada vez más atractivo, ya que son generalmente más baratos, más rápidos, más fáciles de manejar y un informe sólo sobre los componentes …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) y el Instituto Escocés de Señalización Celular (ahora parte de la fosforilación de la proteína MRC y la unidad Ubiquitylation).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
References
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