La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
Heme serve come gruppo prostetico per un'ampia varietà di proteine note come emoproteine, come l'emoglobina, mioglobina e citocromi. E 'coinvolto in vari processi molecolari e cellulari, come la trascrizione genica, la traduzione, la differenziazione cellulare e la proliferazione cellulare. I livelli di biosintesi dell'eme variano nei diversi tessuti e tipi di cellule e è alterata in condizioni di malati come l'anemia, la neuropatia e il cancro. Questa tecnica utilizza [4- 14 C] acido 5-aminolevulinico ([14 C] 5-ALA), uno dei primi precursori della biosintesi dell'eme per misurare i livelli di sintesi dell'eme in cellule di mammifero. Questo test prevede l'incubazione delle cellule con [14 C] 5-ALA seguita da estrazione di eme e misura della radioattività incorporata in eme. Questa procedura è preciso e veloce. Questo metodo misura i livelli relativi di biosintesi dell'eme, piuttosto che il contenuto totale di eme. Per dimostrare l'uso di questo tecnIQUE i livelli di biosintesi sono stati misurati in diverse linee cellulari di mammifero.
Introduction
Eme, un complesso di ferro ferroso e protoporfirina IX è una molecola centrale per il trasporto e l'utilizzo dell'ossigeno negli organismi viventi praticamente tutto 1-3. La struttura unica di eme consente di funzionare come un vettore di gas biatomici ed elettroni, nonché per eseguire varie altre funzioni 1-5. Ad esempio, eme lega all'ossigeno in emoglobina e mioglobina per il trasferimento e lo stoccaggio di 6,7 ossigeno. Funziona anche come un vettore di elettroni nei citocromi durante la respirazione e agisce come un donatore di elettroni per reazioni redox catalizzate da enzimi del citocromo P450 8,9. Una delle caratteristiche più significative di eme è che, può giocare un ruolo di regolamentazione nei processi cellulari e molecolari, come la trascrizione genica, la sintesi proteica e micro-RNA biogenesi 4. Ad esempio, colpisce la trascrizione di molti geni controllando l'attività di mammiferi trascrizionale repressore Bach1 e rec nucleare mammiferieptor Rev-erbα 10-15. Heme regola l'attivazione di proteine eme attivatore (HAP) 1 che svolge un ruolo importante nella attivazione dei geni coinvolti nella respirazione e controllo danno ossidativo, in risposta a eme o ossigeno 16. Eme disciplina anche la trascrizione del gene nelle cellule neuronali attraverso fattore di crescita nervoso (NGF) di segnalazione 3,17-20. Esso regola anche la sintesi delle proteine nelle cellule di mammifero eritroidi modulando l'attività di eme-regolata eIF2α chinasi (HRI) 21-24. Inoltre, eme riguarda l'attività delle proteine chiave di segnalazione quali tirosina chinasi Jak2 e Src, che sono essenziali per il funzionamento delle cellule e la corretta crescita cellulare 4,20,25. Si è constatato che in HeLa inibizione cellule eme provoca arresto del ciclo cellulare e l'attivazione di marcatori associati alla senescenza e apoptosi 26. Entrambi carenza eme o aumento dei livelli di eme sono associati a gravi effetti sulla salute negli esseri umani 27. Recente una molecolarend studi epidemiologici hanno mostrato un'associazione positiva di elevata assunzione di eme e aumento del rischio di malattie, come il diabete di tipo 2, malattia coronarica e di diversi tipi di cancro, tra cui il cancro del polmone, il cancro del colon-retto e del pancreas 27,28. Utilizzando una coppia di laboratorio cellule polmonari normali e tumorali autori hanno scoperto che le cellule tumorali hanno aumentato i livelli di consumo di ossigeno, sintesi dell'eme e proteine coinvolte nella eme assorbimento e di ossigeno utilizzo 28. È interessante notare che l'inibizione della sintesi dell'eme diminuito il consumo di ossigeno, la proliferazione, la migrazione e la colonia formazione di cellule tumorali 28. Così, la fluttuazione dei livelli di eme endogena svolge un ruolo importante nella regolazione dei processi molecolari e cellulari 3,4,28,29.
Nei mammiferi, la biosintesi dell'eme avviene in otto fasi, coinvolgendo enzimi situati nei mitocondri e citosol 4 (figura 1). Heme Biosyntesi inizia nella matrice dei mitocondri con la condensazione di glicina e succinil-CoA per formare acido 5-aminolevulinico (5-ALA), catalizzata da ALA sintasi (ALAS) 4,31. Questo è il fattore limitante nella biosintesi dell'eme nelle cellule nonerythroid. 5-ALA viene poi esportato verso il citoplasma, dove i prossimi quattro fasi si verificano per formare coproporphyrinogen III (CPgenIII), che viene poi reimportato ai mitocondri, dove viene convertito in protoporfirina IX (PPIX). Infine, una molecola di ferro è incorporato alla protoporfirina IX (PPIX) per produrre eme, una reazione catalizzata dalla ferrochelatase (FECH) 2,4.
Il livello di biosintesi dipende principalmente dal livello di ALAS enzima che è strettamente controllata da ferro intracellulare ed eme 4. La biosintesi dell'eme può essere influenzata da difetti genetici, disponibilità di alcuni minerali e vitamine (ad esempio, riboflavina, zinco), l'esposizione a sostanze tossiche (ad esempio, alluminio, piombo), Anossia, febbre, e livelli di alcuni steroidi (per esempio, gli estrogeni) 32-35. Il livello di sintesi dell'eme è alterata in diverse condizioni malate. Diminuzione biosintesi dell'eme può causare anemia così come le malattie neurologiche 3,36. In alternativa, aumento biosintesi dell'eme svolge un ruolo importante nella progressione di alcuni tumori 28,37. Heme ha dimostrato di essere critico per la crescita, la differenziazione e la sopravvivenza di mammiferi adiposo, eritroide e cellule neuronali 4,38-41. Ad esempio, la carenza di eme porta a danni neurite in topo primaria neuroni corticali tramite l'inibizione del glutammato NMDA (N-metil-D-aspartato) receptor 17. Inoltre, l'inibizione della sintesi dell'eme causa la morte cellulare programmata nella cervice carcinoma epiteliale umano cellule HeLa 26,41. Pertanto, misurando i livelli di biosintesi in varie cellule in condizioni diverse è importante per lo studio eziologia e progressisu di molte malattie.
Qui si descrive un metodo rapido e sensibile per misurare il livello di sintesi intracellulare eme utilizzando [4- 14 C] acido 5-aminolevulic. Questo è un metodo alternativo per altri metodi che utilizzano 55 Fe o 59 Fe. Preferiamo usando 14 C, perché la sua radiazione è molto debole. Al contrario, una protezione forte è richiesto per lavorare con isotopi Fe. Inoltre, questo metodo è progettato per misurare e confrontare sintesi dell'eme in celle diverse in parallelo in modo rapido. Per misurare i livelli assoluti eme, si può usare il metodo precedentemente stabilito che coinvolge l'uso di HPLC 42,43.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eme svolge un ruolo chiave nella produzione di energia cellulare attraverso la respirazione 26. Metabolismo alterato eme è noto per essere associato con diverse malattie tra cui il cancro 28,41. L'inibizione della sintesi dell'eme è noto per provocare l'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi in cellule HeLa 26,41. E 'stato dimostrato che il livello di sintesi ad alta eme è associato con la progressione delle cellule tumorali del polmone 28. Pertanto, s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le linee cellulari HCC4017 e HBEC30KT sono stati gentilmente forniti da laboratorio del Dr. John Minna. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi Cecil H. e Ida verdi al dottor Li Zhang.
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
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