Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Heme serve como o grupo prostético de uma grande variedade de proteínas conhecidas como hemoproteinas, tais como a hemoglobina, mioglobina e citocromos. Ele está envolvido em vários processos moleculares e celulares, tais como a transcrição do gene, tradução, diferenciação celular e a proliferação celular. Os níveis de biossíntese do heme variar entre diferentes tecidos e tipos de células e é alterada em condições de doença, tais como a anemia, neuropatia e cancro. Esta técnica utiliza [4- 14 C] ácido 5-aminolevulínico ([14 C] 5-ALA), um dos primeiros precursores na via de biossíntese do heme para medir os níveis de síntese do heme em células de mamíferos. Este ensaio envolve a incubação de células com [14 C] 5-ALA, seguido por extracção do heme e medição da radioactividade incorporada no heme. Este procedimento é preciso e rápido. Este método mede os níveis relativos de heme, em vez de o teor total do heme. Para demonstrar o uso da presente technique os níveis de biossíntese do heme foram medidos em várias linhas de células de mamíferos.
O heme, um complexo de ferro ferroso e protoporfirina IX é uma molécula central para o transporte e a utilização de oxigénio em organismos vivos praticamente todos 1-3. A estrutura única do heme lhe permite funcionar como um transportador de gases diatómicos e electrões, assim como para executar diversas outras funções 1-5. Por exemplo, liga-se ao heme oxigénio na hemoglobina e mioglobina de transferência e armazenagem de 6,7 oxigénio. Ele também funciona como um transportador de electrões nos citocromos durante a respiração e atua como um doador de elétrons para reações redox catalisada por enzimas do citocromo P450 8,9. Uma das características mais significativas do heme é que, pode desempenhar papéis regulatórios em processos celulares e moleculares, como a transcrição de genes, síntese de proteínas e micro-RNA biogênese 4. Por exemplo, afecta a transcrição de muitos genes, controlando a actividade do repressor de transcrição de mamífero Bach1 e o rec nucleares de mamíferoseptor Rev-erbα 10-15. Heme regula a activação do activador de proteína heme (Hap) 1, o qual desempenha um papel importante na activação de genes envolvidos na respiração e controlar os danos oxidativos, em resposta a heme ou oxigénio 16. Heme também regula a transcrição de genes em células neuronais através do factor de crescimento do nervo (NGF) de sinalização 3,17-20. É também regula a síntese de proteínas em células eritróides de mamíferos através da modulação da actividade da heme-reguladas eIF2α quinase (HRI) 21-24. Além disso, o heme afecta a actividade das proteínas principais de sinalização, tais como tirosina-quinase Src e Jak2, que são essenciais para o funcionamento adequado das células e o crescimento de células 4,20,25. Verificou-se que, em células HeLa inibição heme provoca paragem do ciclo celular e a activação de marcadores associados à senescência e a apoptose 26. Tanto a deficiência heme ou aumento dos níveis de heme estão associados com efeitos graves para a saúde em seres humanos 27. Um molecular recentend estudos epidemiológicos têm mostrado uma associação positiva do consumo elevado de heme e aumento do risco de doenças, tais como diabetes tipo 2, doenças coronárias e vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão, cancro colo-rectal e cancro do pâncreas 27,28. Usando um par combinado de laboratório células pulmonares normais e cancerosas autores descobriram que as células cancerosas se aumentaram os níveis de consumo de oxigênio, a síntese do heme e proteínas envolvidas na absorção de oxigênio heme e utilização 28. Curiosamente, a inibição da síntese do heme diminuição do consumo de oxigénio, proliferação, migração e formação de colónias de células de cancro 28. Deste modo, a flutuação nos níveis de heme endógena desempenha um papel importante na regulação de processos celulares e moleculares 3,4,28,29.
Nos mamíferos, a biossíntese do heme ocorre em oito passos, envolvendo enzimas localizadas nas mitocôndrias e o citosol 4 (Figura 1). Heme biostese começa na matriz de mitocôndria com a condensação de glicina e succinil-CoA para formar ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), catalisada por sintase de ALA (Alas) 4,31. Este é o passo limitante da velocidade na biossíntese do heme em células nonerythroid. 5-ALA é então exportado para o citosol onde as quatro etapas seguintes ocorrem para formar coproporfirinogênio III (CPgenIII), o qual é então novamente importados para as mitocôndrias, onde é convertido em protoporfirina IX (PPIX). Finalmente, uma molécula de ferro é incorporado à protoporfirina IX (PPIX) para produzir o heme, numa reacção catalisada por ferroquelatase (FEQ) 2,4.
O nível da biossíntese do heme depende principalmente do nível de enzima ALA que é rigorosamente controlada por ferro intracelular e heme 4. A biossíntese do heme podem ser afectadas por defeitos genéticos, disponibilidade de certos minerais e vitaminas (por exemplo, riboflavina, zinco), exposição a toxinas (por exemplo, alumínio, chumbo), Anoxia, febre, e os níveis de certos esteróides (por exemplo, estrogénio) 32-35. O nível de síntese do heme é alterada em várias condições de doença. Diminuição da biossíntese do heme pode causar anemia, bem como doenças neurológicas 3,36. Alternativamente, o aumento da biossíntese do heme desempenha um papel importante na progressão de certos cancros 28,37. O heme tem sido demonstrado que é crítica para o crescimento, diferenciação e sobrevivência de tecido adiposo de mamífero, eritróide e de células neuronais 4,38-41. Por exemplo, a deficiência de heme leva a danos de neurites em neurónios corticais de rato primária através da inibição de glutamato de NMDA (N-metil-D-aspartato) do receptor 17. Além disso, a inibição da síntese do heme provoca a morte celular programada no humano Carcinoma epitelial do colo células HeLa 26,41. Portanto, a medição dos níveis de biossíntese do heme em várias células sob diferentes condições é importante para o estudo de etiologia e progressino de muitas doenças.
Aqui, descrevemos um método rápido e sensível para medir o nível de síntese do heme intracelular utilizando [4- 14 C] ácido 5-aminolevulic. Este é um método alternativo para os métodos que utilizam outros 55 Fe ou 59Fe. Nós preferimos usar 14 C, porque a sua radiação é muito fraco. Em contraste, a protecção forte é necessário para trabalhar com isótopos Fe. Além disso, este método se destina a medir e comparar a síntese do heme em células diferentes em paralelo de uma maneira rápida. A fim de medir os níveis absolutos de heme, pode-se utilizar o método previamente estabelecido, envolvendo o uso de HPLC de 42,43.
O heme desempenha um papel fundamental na geração de energia celular através da respiração 26. Metabolismo do heme Altered é conhecida por estar associada com várias doenças, incluindo cancro 28,41. A inibição da síntese do heme é conhecido por causar a paragem do ciclo celular e apoptose em células Hela 26,41. Demonstrou-se que o nível de síntese de heme está associada com a progressão de células de cancro de pulmão 28. Portanto, seria de grande importânci…
The authors have nothing to disclose.
As linhas celulares HCC4017 e HBEC30KT foram gentilmente cedidas pelo laboratório do Dr. John Minna. Este trabalho foi apoiado pelos Cecil H. e Ida verdes fundos para Dr. Li Zhang.
Acetone | Sigma | 650501 | |
Diethy ether | Sigma | 296082 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
Trypan blue | Gibco | 15250 | |
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Specific reagent | |||
Component | Dispense | ||
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
Concentrated HCl | 1.3ml | ||
Water | 5ml |