Mätning av hemsyntesen nivåer i däggdjursceller
Summary
Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.
Abstract
Heme tjänar som prostetisk grupp för ett stort antal olika proteiner som kallas hemoproteiner, såsom hemoglobin, myoglobin och cytokrom. Den är involverad i olika molekylära och cellulära processer såsom gen transkription, translation, celldifferentiering och cellproliferation. Biosyntesen nivåer hem varierar mellan olika vävnader och celltyper och förändras i sjukdomstillstånd såsom anemi, neuropati och cancer. Denna teknik använder [4- 14 C] 5-aminolevulinsyra ([14 C] 5-ALA), en av de tidiga prekursorer i heme biosyntesvägen för att mäta nivåerna av hemsyntesen i däggdjursceller. Denna analys innefattar inkubering av celler med [14 C] 5-ALA, följt av extraktion av hem och mätning av radioaktiviteten inkorporeras i heme. Detta förfarande är korrekt och snabb. Denna metod mäter de relativa nivåerna av hembiosyntes snarare än den totala hem innehållet. För att demonstrera användningen av denna TechnIQUE nivåerna av hembiosyntes mättes i flera däggdjurscellinjer.
Introduction
Heme, är ett komplex av ferrojärn och protoporfyrin IX en central molekyl för att transportera och utnyttja syre i så gott som alla levande organismer 1-3. Den unika strukturen av hem gör att den kan fungera som en bärare av diatomic gaser och elektroner, liksom att utföra olika andra funktioner 1-5. Till exempel, binder hem till syre i hemoglobin och myoglobin för överföring och lagring av syre 6,7. Den fungerar också som en elektronbärare i cytokrom under andning och fungerar som en elektrondonator för redoxreaktioner katalyserade av cytokrom P450-enzymer 8,9. En av de viktigaste funktionerna i hem är att det kan spela regulatoriska roller i cellulära och molekylära processer såsom gentranskription, proteinsyntes och mikro RNA biogenes 4. Till exempel, det påverkar transkriptionen av många gener genom att styra aktiviteten hos däggdjurs transkriptionsrepressor Bach1 och däggdjurs nukleära receptor Rev-erbα 10-15. Heme reglerar aktiveringen av heme aktivatorprotein (Hap) en som spelar en viktig roll i aktiveringen av gener involverade i andning och styrning av oxidativ skada, som svar på heme eller syre 16. Heme reglerar också gentranskription i nervceller via nervtillväxtfaktor (NGF) signalering 3,17-20. Det reglerar också proteinsyntes i däggdjurs erytroidceller genom att modulera aktiviteten hos heme-reglerade eIF2α kinas (HRI) 21-24. Dessutom påverkar hem aktiviteten av viktiga signalproteiner såsom tyrosinkinas JAK2 och Src, som är nödvändiga för korrekt cell fungerar och celltillväxt 4,20,25. Det visade sig att i HeLa-celler heme hämning orsakar cellcykelstopp och aktivering av markörer associerade med senescens och apoptos 26. Både Heme brist eller ökade nivåer av hem är förknippade med allvarliga hälsoeffekter hos människor 27. Senaste molekyl ennd epidemiologiska studier har visat ett positivt samband med hög hem intag och ökad risk för sjukdomar, såsom typ-2-diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och flera cancerformer, inklusive lungcancer, tjock- och ändtarmscancer och pankreascancer 27,28. Med hjälp av ett matchat par av normala och cancerlungceller författarnas laboratorium har funnit att cancerceller har ökade nivåer av syreförbrukning, hemsyntesen och proteiner involverade i hem upptag och syre utnyttjande 28. Intressant, minskade hämningar av hemsyntesen syreförbrukning, spridning, migration och kolonibildning av cancerceller 28. Således variationer i nivåerna av endogen hem spelar en viktig roll i regleringen av molekylära och cellulära processer 3,4,28,29.
I däggdjur sker biosyntesen av heme i åtta steg, som involverar enzymer lokaliserade i mitokondrierna och cytosolen 4 (fig 1). Heme Biosynavhandlingen börjar i matrisen av mitokondrier med kondensering av glycin och succinyl-CoA för att bilda 5-aminolevulinsyra (5-ALA), katalyserad av ALA-syntas (ALAS) 4,31. Detta är det hastighetsbegränsande steget i hembiosyntes i nonerythroid celler. 5-ALA sedan exporteras ut till cytosolen där de nästa fyra steg inträffa för att bilda coproporphyrinogen III (CPgenIII), som sedan importeras tillbaka till mitokondrierna, där den omvandlas till protoporfyrin IX (PPIX). Slutligen är en molekyl av järn införlivas till protoporfyrin IX (PPIX) för framställning av heme, en reaktion som katalyseras av ferrokelatas (FECH) 2,4.
Nivån på hembiosyntes beror främst på graden av ALAS enzym som tätt styres av intracellulärt järn och heme 4. Biosyntesen av hem kan påverkas av genetiska defekter, tillgänglighet av vissa mineraler och vitaminer (t.ex., riboflavin, zink), exponering för toxiner (t.ex. aluminium, bly), Anoxi, feber, och nivåerna av vissa steroider (t.ex. östrogen) 32-35. Nivån på hemsyntesen förändras hos olika sjukdomstillstånd. Minskad biosyntesen hem kan orsaka blodbrist samt neurologiska sjukdomar 3,36. Alternativt spelar ökad biosyntes hem en viktig roll i utvecklingen av vissa cancerformer 28,37. Heme har visat sig vara avgörande för tillväxten, differentieringen och överlevnaden av däggdjur fettvävnad, erytroida och nervceller 4,38-41. Exempelvis leder heme-brist till neurite skada i primära mus kortikala neuroner via inhibition av glutamat NMDA (N-metyl-D-aspartat) -receptor 17. Dessutom, hämning av hemsyntesen orsakar programmerad celldöd i människans epitel cervix carcinoma HeLa-celler 26,41. Därför är det viktigt för att studera etiologi och progressi mäta hembiosyntes nivåer i olika celler under olika betingelserpå många sjukdomar.
Här beskriver vi en snabb och känslig metod för att mäta nivån av intracellulär hemsyntesen genom användning av [4- 14 C] 5-aminolevulic syra. Detta är en alternativ metod för att andra metoder som använder 55 Fe eller 59 Fe. Vi föredrar att använda 14 C, eftersom dess strålning är mycket svag. Däremot krävs ett starkt skydd för att arbeta med Fe isotoper. Dessutom är denna metod till syfte att mäta och jämföra hemsyntesen i olika celler parallellt på ett snabbt sätt. För att mäta absoluta heme nivåer, kan man använda den tidigare etablerad metod som omfattar användning av HPLC 42,43.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heme spelar en nyckelroll i uppkomsten av cell energi via andning 26. Förändrad hem ämnesomsättning är känd för att vara förknippade med olika sjukdomar, bland annat cancer 28,41. Inhibering av hemsyntesen är känt för att orsaka cellcykelstopp och apoptos i Hela-celler 26,41. Det har visats att hög hemsyntesen nivå är förknippad med utvecklingen av lungcancerceller 28. Därför skulle det vara av stor betydelse för att mäta nivåerna av hembiosyntes i celler u…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De HCC4017 och HBEC30KT cellinjer tillhandahölls vänligen av Dr John Minna labb. Detta arbete stöddes av Cecil H. och Ida Gröna medel till Li Zhang.
Materials
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store @ -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | |||
| Component | Dispense | ||
| Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5) | Acetone | 25ml | |
| Concentrated HCl | 1.3ml | ||
| Water | 5ml |
References
- Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
- Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
- Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
- Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
- Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
- Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
- Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
- Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
- Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
- Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
- Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
- Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
- Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
- Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
- Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
- Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 169, 1343-1352 (2005).
- Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
- Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
- Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
- Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
- Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
- Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
- Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
- Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
- Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
- Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
- Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
- Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
- Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
- Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
- Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
- Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
- Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, 37-53 (1997).
- Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
- Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
- Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , 1-53 (2009).
- Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
- Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
- Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
- Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
- Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
- Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
- Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
- Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
- Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
- Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
- Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
- Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
- Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
- Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
- Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
- Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).
