मानव आईपीएस कोशिकाओं के microRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल, आईपीएस से व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला, और भ्रूण रेटिना वर्णक उपकला
Summary
microRNA (miRNA) मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) कोशिकाओं (आईपीएस RPE), और भ्रूण RPE से व्युत्पन्न मानव प्रेरित pluripotent स्टेम की प्रोफाइल (आईपीएस) कोशिकाओं, रेटिना वर्णक उपकला (RPE), की तुलना में थे.
Abstract
इस रिपोर्ट का उद्देश्य microRNA (miRNA) मानव आईपीएस कोशिकाओं (आईपीएस) RPE से व्युत्पन्न मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) कोशिकाओं, रेटिना वर्णक उपकला (RPE), और भ्रूण RPE के प्रोफाइल की तुलना के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है. प्रोटोकॉल माइक्रोएरे द्वारा विश्लेषण के लिए शाही सेना का संग्रह है, और विभिन्न प्रकार से तीन प्रकार की कोशिकाओं के बीच व्यक्त कर रहे हैं कि miRNAs की पहचान करने के लिए माइक्रोएरे डेटा का विश्लेषण शामिल हैं. आईपीएस कोशिकाओं और भ्रूण RPE की संस्कृति के लिए तरीकों से समझाया जाता है. मानव आईपीएस से RPE के भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल भी वर्णन किया गया है. हम वर्णन शाही सेना निकासी तकनीक एक miRNA माइक्रोएरे में उपयोग के लिए बहुत छोटे आरएनए की अधिक से अधिक वसूली की अनुमति के लिए चुना गया था. अंत में, सेलुलर मार्ग और माइक्रोएरे डेटा के नेटवर्क विश्लेषण समझाया गया है. इन तकनीकों में तीन अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं की miRNA प्रोफाइल के तुलना की सुविधा होगी.
Introduction
स्टेम कोशिकाओं सीमा और किसी भी दैहिक सेल प्रकार में अंतर करने की क्षमता के बिना दोहराने की क्षमता है. व्यक्तिगत ऊतक उत्थान के आगमन के क्षितिज 1 पर है के रूप में pluripotent स्टेम सेल में दैहिक कोशिकाओं reprogram करने के लिए तकनीक का विकास, अनुसंधान समुदाय में और चिकित्सकों के बीच काफी उत्साह भी हासिल हुआ है. ESCs के साथ जुड़े नैतिक दुविधाओं circumventing जबकि प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) कोशिकाओं (ते) कोशिकाओं को भ्रूण स्टेम रूप में असीमित replicative क्षमता और pluripotency की एक ही सुविधाओं दिखा रहे हैं. इसके अलावा, रोगी व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं बहुत सफल चिकित्सीय अनुप्रयोगों 2-3 की संभावना बढ़ रही है, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित नहीं करेंगे. विशिष्ट संस्कृति शर्तों के तहत, आईपीएस कोशिकाओं cardiomyocytes, न्यूरॉन्स, अग्नाशय बीटा कोशिकाओं, hepatocytes, और रेटिना वर्णक उपकला (आरपी सहित इन विट्रो में कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं में अंतर दिखाया गया हैई) 4-12.
RPE उत्पादन के लिए एक विशेष तरह के फोटोरिसेप्टर बाहरी क्षेत्रों के आवारा प्रकाश, phagocytosis के अवशोषण के रूप में दृश्य स्वास्थ्य और समारोह के लिए आवश्यक हैं कि कई कार्य करता है कि रेटिना के पीछे स्थित pigmented उपकला कोशिकाओं की परत, और retinoids के प्रसंस्करण है दृश्य क्रोमोफोर की. ऐसी उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (AMD) Stargardt रोग, और रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आर) के रूप में अंतर्निहित RPE विकृति का परिणाम हैं कि चकाचौंध रोगों से सबूत के रूप में होने के कारण क्षति या बीमारी के लिए RPE की शिथिलता गहराई से फोटोरिसेप्टर स्वास्थ्य और दृश्य समारोह को प्रभावित करता है 13. दृष्टि बहाल कर सकते हैं कि वास्तव में प्रभावी उपचार हासिल नहीं किया गया है, और स्वस्थ RPE साथ रोगग्रस्त RPE के प्रतिस्थापन दृष्टि 14-15 के नुकसान को रोकने के लिए सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है. आईपीएस (आईपीएस) RPE से व्युत्पन्न RPE क्षतिग्रस्त RPE को बदलने के लिए कोशिकाओं का एक संभावित स्रोत है. आईपीएस RPE characteris व्यक्त करता हैटिक RPE प्रोटीन LRAT, CRALBP, PEDF, और RPE65; शास्त्रीय अत्यधिक pigmented हेक्सागोनल RPE आकारिकी प्रदर्शित करता है; सीआईएस रेटिना 5,16 – और इस तरह phagocytosis, retinoid प्रसंस्करण, और 11 के स्राव के रूप में RPE कार्य करता है. आईपीएस RPE therapeutically इस्तेमाल किया जा सकता है हालांकि, इससे पहले, आईपीएस RPE अच्छी तरह से विशेषता किया जाना चाहिए. RPE भेदभाव को नियंत्रित करने वाले कारकों को समझना नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं की उपज और पवित्रता में सुधार करने के लिए आवश्यक है.
सेल भेदभाव उच्च विनियमित जीन अभिव्यक्ति का परिणाम है. प्रतिलेखन कारक के जीनोम और समन्वय के epigenetic remodeling भेदभाव और विकास 17 के दौरान होने वाले सेल भाग्य के फैसले के लिए आवश्यक हैं. MicroRNA (miRNA) द्वारा संदेश शाही सेना (mRNA) अनुवाद का विनियमन सेल भाग्य 1 को प्रभावित करता है कि विनियमन का एक और स्तर प्रस्तुत करता है. MiRNAs कम कर रहे हैं, ~ 22 NT, nucleotides की लंबाई कि दबाने अनुवाद के द्वारा या तोmRNA की 3 'UTR के लिए बाध्य या गिरावट के लिए mRNA लक्ष्य. MiRNAs लगभग सभी ऊतकों में पाया गया है और आज तक 2,000 से अधिक अद्वितीय मानव microRNAs miRBase डेटाबेस में पंजीकृत किया गया है. यानी एक ही mRNA कई अलग miRNAs द्वारा लक्षित किया जा सकता है; miRNAs लक्ष्य mRNA करने के लिए बाध्य करने के लिए केवल आंशिक पूरकता की आवश्यकता के बाद से, एक भी miRNA संभावित दसियों या लक्ष्य के सैकड़ों, और इसके विपरीत करने के लिए बाध्य कर सकते हैं. यह अनेक बंधन विशेषता नाटकीय रूप से नियमन की जटिलता के स्तर के साथ ही व्यक्ति miRNAs के कार्यों का निर्धारण करने की कठिनाई के स्तर और भूमिका सेलुलर कार्यों 18-21 में प्रत्येक नाटकों बढ़ जाती है. फिर भी, पढ़ाई miRNA डीएनए मेथिलिकरण स्थिति 17 को प्रभावित करने से भेदभाव के दौरान जीन अभिव्यक्ति को परिष्कृत दिखाया है. RPE को अधिक विशिष्ट एक अध्ययन में, miR-204/211 RPE 22 की उपकला फेनोटाइप बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था. एक अन्य समूह miRNA प्रोफाइल का विश्लेषणRPE के ES कोशिकाओं से भेदभाव के दौरान और miRNA के अलग सेट से पता चला भेदभाव प्रक्रिया 23 के दौरान व्यक्त कर रहे हैं. वास्तव में, miRNA प्रोफाइल के असंदिग्ध रूप ES कोशिकाओं, अग्रदूत साबित कोशिकाओं, और टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं 24,25 सहित सेल प्रकार भेद कर सकते हैं. 250 से अधिक miRNAs रेटिना में व्यक्त कर रहे हैं. इन अध्ययनों के आधार पर, हम miRNAs आईपीएस से RPE के भेदभाव के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा परिकल्पना है कि.
इस रिपोर्ट का उद्देश्य IMR90-4 आईपीएस से RPE के भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है कोशिकाओं, माइक्रोएरे द्वारा विश्लेषण के लिए शाही सेना का संग्रह है, और विभिन्न प्रकार से तीन प्रकार की कोशिकाओं के बीच व्यक्त कर रहे हैं कि miRNAs, आईपीएस कोशिकाओं की पहचान करने के लिए माइक्रोएरे डेटा का विश्लेषण , आईपीएस RPE और भ्रूण RPE. कुल शाही सेना प्रत्येक कोशिका प्रकार की संस्कृतियों से निकाली गई और 1,205 मानव miRNAs और 144 वायरल miRNAs के लिए विशेष जांच युक्त, एक miRNA माइक्रोएरे संकरित किया गया था. माइक्रोएरे परिणामों की तुलना गयाmiRNAs विभिन्न विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच व्यक्त कर रहे थे, जो निर्धारित करने के लिए डी. 2 गुना या अभिव्यक्ति में अधिक से अधिक गुना परिवर्तन के साथ miRNAs आगे के विश्लेषण के लिए चयन किया गया था. एक miRNA विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम विभिन्न व्यक्त miRNAs के संभावित ठिकानों की पहचान करने के लिए और चयनित miRNAs द्वारा विनियमित सेलुलर नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
Protocol
Representative Results
Discussion
अंत में, इस रिपोर्ट संस्कृति आईपीएस कोशिकाओं तरीकों का इस्तेमाल किया, आईपीएस RPE, और भ्रूण RPE का वर्णन करता है. आईपीएस से व्युत्पन्न RPE आकृति विज्ञान और कार्यात्मक भ्रूण RPE के समान हैं. आईपीएस RPE भी RPE65, CRALBP, PEDF, और …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहाँ निहित राय या दावे लेखकों के निजी विचार हैं और अधिकारी के रूप में या सेना के विभाग या रक्षा विभाग के विचारों को दर्शाती के रूप में लगाया जा नहीं रहे हैं.
लेखकों व्हिटनी ए ग्रीन, अल्बर्टो Muñiz, और रमेश आर Kaini USAISR पर एक राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद Postdoctoral रिसर्च एसोसिएटशिप आयोजित करते हुए इस शोध का प्रदर्शन किया गया था.
माइक्रोएरे assays Greehey बच्चों के कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट माइक्रोएरे कोर सुविधा और केन्द्र शासित प्रदेशों के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र सैन एंटोनियो में जैव सूचना विभाग द्वारा प्रदर्शन किया गया.
यह काम अमेरिकी सेना क्लीनिकल पुनर्वास चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (CRMRP) और सैन्य संचालन चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (MOMRP) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
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