MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel
Summary
De microRNA (miRNA) profielen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen, retinale pigment epitheel (RPE) afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen (iPS-RPE), en foetale RPE, werden vergeleken.
Abstract
Het doel van dit rapport is om de protocollen te beschrijven voor het vergelijken van de microRNA (miRNA) profielen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen, retinale pigment epitheel (RPE), afkomstig van menselijke iPS cellen (iPS-RPE), en foetale RPE. De protocollen omvatten collectie van RNA voor analyse door middel van microarray, en de analyse van microarray data te miRNAs een differentiële expressie tussen drie soorten cellen te identificeren. De methoden voor de cultuur van iPS cellen en foetale RPE worden toegelicht. Het protocol voor differentiatie van RPE uit menselijke iPS wordt ook beschreven. De RNA-extractie techniek beschrijven we geselecteerd om maximale terugwinning van zeer kleine RNA voor gebruik in een miRNA microarray mogelijk. Tenslotte wordt cellulaire weg en netwerk analyse van microarray data toegelicht. Deze technieken zullen de vergelijking van de miRNA profielen van drie verschillende celtypen vergemakkelijken.
Introduction
Stamcellen hebben het vermogen om te repliceren zonder beperking en kunnen differentiëren in een somatische celtype. De ontwikkeling van technieken om somatische cellen te herprogrammeren in pluripotente stamcellen heeft uitgelokt grote opwinding in de onderzoekswereld en onder clinici, zoals de komst van gepersonaliseerde weefselregeneratie is aan de horizon 1. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vertonen dezelfde kenmerken van onbegrensde replicatieve potentieel en pluripotency als embryonale stamcellen (ES) cellen, terwijl het omzeilen van de ethische dilemma's in verband met SER. Bovendien zal-patiënt afgeleide stamcellen geen immuunrespons stimuleren aanzienlijke verhoging van de kans op succesvolle therapeutische toepassingen 2-3. Onder specifieke kweekomstandigheden, zijn iPS cellen is aangetoond differentiëren in verschillende celtypes in vitro, zoals cardiomyocyten, neuronen, pancreatische beta-cellen, hepatocyten en retinale pigmentepitheel (RPE) 4-12.
De RPE is een gespecialiseerde laag van gepigmenteerde epitheelcellen aan de achterkant van het netvlies dat verschillende functies die essentieel zijn voor visuele gezondheid en functioneren zoals absorptie van strooilicht, fagocytose van de fotoreceptor buitenste segmenten voert en verwerking van retinoïden voor de productie van visuele chromofoor. Disfunctie van de RPE als gevolg van schade of ziekte beïnvloedt diepgaand gezondheid photoreceptor en visuele functie, zoals blijkt uit de verblindende ziekten die het gevolg zijn van onderliggende RPE pathologie zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de ziekte van Stargardt, en retinitis pigmentosa (RP) zijn 13. Echt effectieve behandelingen die visie kan herstellen niet zijn verwezenlijkt, en de vervanging van zieke RPE met gezonde RPE kan de beste optie om het verlies van het gezichtsvermogen 14-15 voorkomen. RPE afgeleid van iPS (iPS-RPE) is een mogelijke bron van cellen om de beschadigde RPE vervangen. iPS-RPE uitdrukt kenmerkentic RPE eiwitten LRAT, CRALBP, PEDF en RPE65; geeft de klassieke hoog gepigmenteerde zeshoekig RPE morfologie; RPE en voert functies uit zoals fagocytose, retinoid verwerking en secretie van 11 – cis retinal 5,16. Echter, voordat iPS-RPE therapeutisch kan worden gebruikt, de iPS-RPE moet grondig worden gekarakteriseerd. Inzicht in de factoren die RPE differentiatie regelen moet de opbrengst en zuiverheid van de cellen worden gebruikt voor klinische toepassingen te verbeteren.
Celdifferentiatie is het gevolg van de sterk gereguleerde genexpressie. Epigenetische hermodellering van het genoom en de coördinatie van transcriptiefactoren zijn vereist voor cellot beslissingen die optreden tijdens differentiatie en ontwikkeling 17. Regulering van bericht RNA (mRNA) vertaling door microRNA (miRNA) presenteert nog een ander niveau van regelgeving die cel lot 1 beïnvloedt. MiRNAs zijn kort, ~ 22 nt, lengtes van nucleotiden die ofwel onderdrukken vertaling doorbinden aan de 3 'UTR van mRNA of gewenste mRNA voor de afbraak. MiRNAs zijn ontdekt in vrijwel alle weefsels en tot op heden meer dan 2.000 unieke menselijke microRNAs hebben in de miRBase databank geregistreerd. Omdat miRNAs vereisen slechts gedeeltelijk complementair te binden aan de doelwit mRNA kan een miRNA mogelijk binden aan tientallen of honderden doelen, en vice versa, dat wil zeggen een mRNA kunnen worden gericht door verschillende miRNAs. Dit promiscue bindende eigenschap drastisch verhoogt het niveau van complexiteit van regelgeving, alsmede de moeilijkheidsgraad van het bepalen van de functies van de individuele miRNAs en de rol die elk speelt in cellulaire functies 18-21. Toch hebben studies aangetoond dat miRNA verfijnt genexpressie tijdens de differentiatie door het beïnvloeden van DNA-methylatie status van 17. In een studie specifieker voor het RPE, werd miR-204/211 getoond om de epitheliale fenotype van de RPE 22 bevorderen. Een andere groep analyseerde de miRNA profielvan RPE tijdens differentiatie van ES-cellen en onthulde verschillende sets van miRNA expressie tijdens de differentiatie proces 23. In feite kan miRNA profielen ondubbelzinnig onderscheid celtypen, waaronder ES-cellen, precursorcellen en terminaal gedifferentieerde cellen 24,25. Meer dan 250 miRNAs worden uitgedrukt in het netvlies. Op basis van deze studies, veronderstellen we dat miRNAs spelen een belangrijke rol tijdens de differentiatie van RPE van iPS.
Het doel van dit rapport is om de protocollen voor de differentiatie van RPE beschrijven uit IMR90-4 iPS cellen, de verzameling van RNA voor analyse door middel van microarray, en de analyse van microarray data te miRNAs een differentiële expressie tussen drie soorten cellen, iPS cellen te identificeren , iPS-RPE en foetale RPE. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit kweken van elk celtype en gehybridiseerd met een miRNA microarray, probes specifiek voor menselijke miRNAs 1205 en 144 virale miRNAs. De microarray resultaten werden vergelijkend te bepalen welke miRNAs differentieel tot expressie tussen de verschillende celtypen. miRNAs met 2 keer of meer voudige verandering in expressie werden geselecteerd voor verdere analyse. Een miRNA analyse software programma werd gebruikt om potentiële doelwitten van de differentieel tot expressie miRNA's identificeren en mobiele netwerken gereguleerd door de geselecteerde miRNAs genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kortom, dit rapport beschrijft de methoden die worden gebruikt om de cultuur iPS cellen, iPS-RPE, en foetale RPE. RPE afgeleid van iPS zijn morfologisch en functioneel vergelijkbaar met foetale RPE. De iPS-RPE spreekt ook kenmerkend RPE genen waaronder RPE65, CRALBP, PEDF en LRAT 16. Om verder te karakteriseren deze cellen, werd RNA geëxtraheerd en gebruikt om microarray-analyse uit te voeren om differentieel tot expressie miRNA identificeren. Analyse van het signaal intensiteiten bleek dat het grootste aant…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De meningen of beweringen hierin zijn de particuliere standpunten van de auteurs en zijn niet te worden opgevat als ambtenaar of als een afspiegeling van de opvattingen van het Ministerie van het Leger of het ministerie van Defensie.
Dit onderzoek werd uitgevoerd terwijl de auteurs Whitney A. Greene, Alberto Muñiz en Ramesh R. Kaini hield een National Research Council Postdoctoraal Research Associate bij de USAISR.
Microarray testen werden uitgevoerd door de Greehey Children's Cancer Research Institute Microarray Core Facility en Bioinformatica afdeling UT Health Science Center in San Antonio.
Dit werk werd ondersteund door de US Army Klinische Revalidatie Geneeskunde Research Program (CRMRP) en Militaire Operationele Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
