MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell'epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell'epitelio pigmentato retinico
Summary
I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.
Abstract
L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per confrontare il microRNA (miRNA) profili di umana indotta staminali pluripotenti (iPS), dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivato da cellule iPS umane (iPS-RPE), e RPE fetale. I protocolli includono raccolta di RNA per l'analisi mediante microarray e l'analisi dei dati di microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi tra i tre tipi di cellule. I metodi per la coltura di cellule iPS e RPE fetale sono spiegati. Il protocollo utilizzato per la differenziazione di RPE da IP umano è anche descritto. La tecnica di estrazione dell'RNA descriviamo stato selezionato per consentire il recupero massimo molto piccolo RNA per l'uso in un microarray miRNA. Infine, via cellulare e analisi della rete dei dati di microarray è spiegato. Queste tecniche facilitare il confronto dei profili miRNA di tre differenti tipi cellulari.
Introduction
Le cellule staminali hanno la capacità di replicarsi senza limiti e il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. Lo sviluppo di tecniche per riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti ha suscitato grande entusiasmo nella comunità della ricerca e tra i medici, come l'avvento di rigenerazione del tessuto personalizzato è all'orizzonte 1. Induced-staminali pluripotenti (iPS) presentano le stesse caratteristiche di illimitato potenziale replicativo e pluripotenza come staminali embrionali (ES), le cellule che aggirano i dilemmi etici associati con i CES. Inoltre, le cellule staminali del paziente non stimolare una risposta immunitaria, aumentando notevolmente la probabilità di successo applicazioni terapeutiche 2-3. Sotto specifiche condizioni di coltura, le cellule iPS hanno dimostrato di differenziarsi in diversi tipi cellulari in vitro, compresi cardiomiociti, neuroni, cellule beta pancreatiche, epatociti e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) 4-12.
La RPE è uno strato specializzato di cellule epiteliali pigmentate situati nella parte posteriore della retina che svolge diverse funzioni che sono essenziali per la salute visiva e funzione come assorbimento della luce diffusa, fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, e l'elaborazione di retinoidi per la produzione di chromophore visiva. Disfunzione del RPE causa di danni o malattia colpisce profondamente la salute dei fotorecettori e la funzione visiva come testimoniano le malattie accecante che sono il risultato della sottostante patologia RPE come la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la malattia di Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Trattamenti veramente efficaci che possono ripristinare la visione non sono stati raggiunti, e la sostituzione di RPE malato con sano RPE può essere l'opzione migliore per prevenire la perdita della visione 14-15. RPE derivate da iPS (iPS-RPE) è una possibile fonte di cellule per sostituire il RPE danneggiato. iPS-RPE esprime caratteristiproteine RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; visualizza la classica altamente pigmentato esagonale RPE morfologia; e svolge funzioni RPE come la fagocitosi, l'elaborazione retinoidi, e la secrezione di 11 – cis 5,16 retinica. Tuttavia, prima di iPS-RPE può essere utilizzato terapeuticamente, IPS-RPE deve essere accuratamente caratterizzato. Comprensione dei fattori che regolano la differenziazione RPE è necessario per migliorare la resa e la purezza delle cellule da utilizzare per applicazioni cliniche.
La differenziazione cellulare è il risultato dell'espressione genica altamente regolato. Rimodellamento epigenetico del genoma e del coordinamento dei fattori di trascrizione sono necessari per le decisioni destino delle cellule che si verificano durante la differenziazione e lo sviluppo 17. Regolamento del messaggio RNA messaggero (mRNA), traduzione di microRNA (miRNA) presenta ancora un altro livello di regolamentazione che riguarda il destino delle cellule 1. MiRNAs sono brevi, ~ 22 nt, lunghezze di nucleotidi che sia la traduzione di soppressione dalegame al 3 'UTR del mRNA bersaglio o l'mRNA per degradazione. MiRNAs sono stati rilevati in quasi tutti i tessuti e ad oggi oltre 2.000 microRNA umani unici sono stati registrati nel database miRBase. Poiché miRNA richiedono complementarità soltanto parziale di legarsi al mRNA bersaglio, un singolo miRNA può potenzialmente legarsi a decine o centinaia di bersagli, e viceversa, cioè un singolo mRNA può essere bersaglio di diversi miRNA diversi. Questa caratteristica vincolante promiscua aumenta notevolmente il livello di complessità della regolamentazione, così come il livello di difficoltà di determinare le funzioni dei singoli miRNA e il ruolo ognuno gioca in funzioni cellulari 18-21. Tuttavia, studi hanno dimostrato che miRNA raffina genica durante il differenziamento influenzando stato di metilazione del DNA 17. In uno studio più specifico al RPE, miR-204/211 ha dimostrato di promuovere il fenotipo epiteliale della RPE 22. Un altro gruppo ha analizzato il profilo di miRNAdi RPE durante il differenziamento di cellule ES e ha rivelato insiemi distinti di miRNA sono espressi durante il processo di differenziazione 23. In realtà, i profili miRNA possono distinguere in modo inequivocabile tipi cellulari, comprese le cellule staminali, cellule precursori e cellule terminalmente differenziate 24,25. Oltre 250 miRNA sono espressi nella retina. Sulla base di questi studi, ipotizziamo che i microRNA svolgono un ruolo importante durante la differenziazione di RPE da iPS.
L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per il differenziamento di RPE da IMR90-4 cellule iPS, la raccolta di RNA per l'analisi mediante microarray e l'analisi dei dati di microarray per identificare miRNA che sono differenzialmente espressi fra tre tipi di cellule, le cellule iPS , iPS-RPE e RPE fetale. L'RNA totale è stato estratto da colture di ogni tipo di cellula e ibridato a un microarray miRNA, contenente sonde specifiche per il 1205 miRNA umani e 144 miRNA virali. I risultati microarray sono stati confrontanod per determinare quali miRNA sono differenzialmente espressi tra i diversi tipi cellulari. miRNA con 2 volte o più fold change in espressione sono stati selezionati per ulteriore analisi. Un programma software di analisi miRNA è stato usato per identificare potenziali target dei miRNA differenzialmente espressi e generare reti cellulari regolati dai miRNA selezionati.
Protocol
Representative Results
Discussion
In conclusione, la relazione descrive i metodi utilizzati per la coltura delle cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale. RPE derivate da iPS sono morfologicamente e funzionalmente simile a RPE fetale. IPS-RPE esprime anche caratteristici geni RPE tra cui RPE65, CRALBP, PEDF, e LRAT 16. Per caratterizzare ulteriormente queste cellule, l'RNA è stato estratto e utilizzato per eseguire analisi microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi. Analisi delle intensità di segnale rivelato che è stato ril…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o quanto riflette le opinioni del Dipartimento dell'Esercito o il Dipartimento della Difesa.
Questa ricerca è stata eseguita mentre Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, e Ramesh R. Kaini gli autori hanno tenuto una Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche presso l'USAISR.
Microarray sono stati eseguiti dai bambini del Greehey Cancer Research Institute Microarray Nucleo Facility e Bioinformatica Dipartimento presso UT Health Science Center a San Antonio.
Questo lavoro è stato supportato dal US Army programma clinico di Medicina Riabilitativa Research (CRMRP) e militare Programma di Ricerca Operativa Medicina (MOMRP).
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
