Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.
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Article de méthode
Profils MicroRNA d'expression de cellules iPS humaines, l'épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour comparer le profil des anthropique-souches pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS humaines (iPS-RPE), et RPE fœtale microRNA (miRNA). Les protocoles comprennent la collecte de l'ARN pour l'analyse par puces à ADN, et l'analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules. Les méthodes de culture de cellules iPS et RPE fœtale sont expliqués. Le protocole utilisé pour la différenciation de l'EPR de iPS humaines est également décrite. La technique d'extraction d'ARN, nous décrivons a été choisie pour permettre une récupération maximale de l'ARN très faible pour une utilisation dans un microréseau miARN. Enfin, voie cellulaire et l'analyse du réseau de données de puces à ADN est expliqué. Ces techniques vont faciliter la comparaison des profils de miARN de trois types de cellules différents.
Introduction
Les cellules souches ont la capacité de se répliquer sans limite et le potentiel de se différencier en n'importe quel type de cellules somatiques. Le développement des techniques de reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes a suscité beaucoup d'enthousiasme dans la communauté des chercheurs et des cliniciens, comme l'avènement de la régénération des tissus personnalisé à l'horizon 1. Induire-souches pluripotentes (iPS) présentent les mêmes caractéristiques de potentiel réplicatif illimité et pluripotence comme souches embryonnaires (ES) des cellules tout en contournant les dilemmes éthiques liés à la CES. En out....
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Protocole
1. Préparation de la Culture Réactifs et Culture Plaques
- mTeSR1 médias: Préparer médias mTeSR1 selon les instructions du fabricant. Décongeler 100 ml de supplément mTeSR1 5x nuit à 4 ° C. Ajouter 100 ml de supplément mTeSR1 5x 400 ml de mTeSR1 milieux de base et bien mélanger. Ce support est stable à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines et à -20 ° C pendant 6 mois.
- médias de différenciation: Préparez le support de différenciation dans DMEM/F12 pour obtenir 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 2,0 mM de L-glutamine, sérum de KO de 10%, et 10 pg / ml de gentamicine.
- iPS-RPE médias: Préparer médias iPS-RPE dans ME....
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Résultats
cellules iPS (figure 1A) ont été cultivées dans des conditions de différenciation pour induire la différenciation en cellules iPS-RPE. L'IPS-RPE exposé classique phénotype de l'EPR de hexagonal pigmentée morphologie cellulaire (figure 1B) similaire à RPE fœtale (figure 1C).
Pour mieux comprendre le rôle que peut jouer miRNA au cours du processus de différenciation de cellules iPS à iPS-RPE, l'analyse des microréseaux d'expres.......
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Discussion
En conclusion, ce rapport décrit les méthodes utilisées pour la culture de cellules iPS, iPS-RPE, et RPE fœtale. EPR dérivé de iPS sont morphologiquement et fonctionnellement similaire à RPE fœtale. L'IPS-RPE exprime aussi des gènes de RPE caractéristiques dont RPE65, CRALBP, PEDF, et LRAT 16. Pour mieux caractériser ces cellules, l'ARN a été extrait et utilisé pour effectuer l'analyse des microréseaux d'identifier exprimé de manière différentielle miARN. Analyse des intensités de signal a rév.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Les opinions exprimées dans le présent article sont celles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme fonctionnaire ou comme reflétant les vues du Département de l'Armée ou le ministère de la Défense.
Cette recherche a été réalisée alors que les auteurs Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, et Ramesh R. Kaini tenu un attaché de recherche postdoctorale du Conseil national de recherches à l'USAISR.
analyses de biopuces ont été effectuées par l'Institut de recherche sur le cancer de puces à ADN base la facilité de la Greehey enfants et Département bioinformatique à l'UT Health Science Cente....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu mTeSR1 + supplément 5X | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-&beta ;-mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Acides aminés non essentiels | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout sérum de remplacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicine ; | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplément | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Sérum fœtal bovin | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sel sodique | Sigma | T6397 | |
| Hydroxyde de sodium | Sigma | S5881 | |
| Média RPE fœtal Kit RTEGM | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Saline tamponnée au phosphate | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsine | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Tampon de lavage Miltenyi Biotec | StemGent | 130-092-987 | |
| Tampon de rinçage Miltenyi Biotec | StemGent | 130-092-222 | |
| Kit de microbilles Anti-TRA-1-60 | StemGent | 130-095-816 | |
| Colonne de tri cellulaire Miltenyi Biotec | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Broyeur QIA | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Microarray miARN humain v16 | Agilent | G4471A |
Références
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS....
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Réimpressions et autorisations
